La tossicità dei metalli pesanti

TOSSICITA’ DEI METALLI PESANTI
Essenziali e non tossici:
Ca, Mg
Essenziali ma tossici
ad alte concentrazioni:
Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni, Mo
Tossici:
Hg, Cd
Per alcuni metalli la tossicità dipende dalla specie chimica
in cui si trova più che dall’elemento in quanto tale.
La tossicità dei metalli pesanti
M2+ + H-S-H
R-S-H + M2+ + H-S-R
MS + 2H+
R-S-M-S-R + 2H+
M = Hg, Pb, Cd
Gruppi R-S-H di proteine possono produrre specie
stabili come R-S-M-S-R
Hg, Pb, Cd possono spostare i metalli fisiologici (p.es.
Zn) dal loro sito di legame
Trattamento medico: utilizzo di chelanti
EDTA etilendiaminotetracetato di sodio
BAL British Anti-Lewis 2,3 dimercaptopropanolo
Harrison, Ceri & Turner, Nature Reviews Microbiology 5, 928-938 (2007)
La tossicità dei metalli pesanti
 Natura dell’elemento
 Concentrazione
 Speciazione
 Disponibilità
Un caso:
CH3-Hg+ > Hg(II) e Cl-composti > Hg(0)g (volatile)
(CH3) 2Hg (vol. non reattivo) > HgS
Metil(o alchil)-mercurio traversa più facilmente la
barriera emato-encefalica (causa disturbi al sistema
nervoso centrale, p.e.s malattia di Minamata, 1950)
Speciazione è la distribuzione di un metallo nelle sue
varie specie chimiche
Bioaccumulazione
 La concentrazione del metallo aumenta progressivamente lungo la
concentrazione
catena alimentare
 Quanto un metallo si accumula in un organismo dipende dalla velocita’
R di assorbimento della fonte e dalla velocità di eliminazione
Velocità di assorbimento = R
Velocità di eliminazione = kC
La velocità di eliminazione
aumenta con la concentrazione
Caso limite è lo stato stazionario kC = R
Css=R/k
tempo
Stato stazionario
Velocità di eliminazione = Velocità di assorbimento
kCss = R
Se ne parla in termini di tempo di vita media t0.5
Dall’analisi matematica delle cinetiche del primo ordine è noto che
k = 0.69/t0.5
Css = Rt0.5/0.69 = 1.45 Rt0.5
Più alto è il tempo di vita media di un metallo in un organismo maggiore
è il suo accumulo in condizioni stazionarie
Hg2+ nel corpo umano ha t0.5 = 6 d
Ostriche e molluschi possono contenere Hg2+ a concentrazioni mille volte
maggiori di quelle delle acque di mare
TUTTI I BATTERI CONTENGONO GENI PER LA
RESISTENZA A IONI METALLICI TOSSICI:
Ag+, AsO2-, Cd2+, Co2+, CrO42-, Cu2+, Hg2+, Ni2+, Pb2+,
TeO32-, Tl+, Zn2+.
Trasporto attivo
di ioni
fuori dalla cellula
Proteine
che legano
metalli
Trasformazioni
enzimatiche
Fin dall’inizio della vita sulla terra i microorganismi sono venuti in contatto
con metalli tossici presenti sul pianeta, quindi hanno sviluppato meccanismi
di resistenza molto conservati nel tempo e tra le diverse specie.
METODI DI BIORISANAMENTO DA METALLI PESANTI
CON MICROORGANISMI
3
1.
Bioprecipitazione:
batteri solfato riduttori
possono utilizzare il solfato
come accettore di elettroni
e precipitare i metalli
come solfuri insolubili
2. Biotrasformazione/
Biovolatilizzazione:
trasformazioni in forme
meno tossiche.
3. Bioassorbimento:
2
proteine chelanti dei metalli
fuse a proteine transmembrana (es: LamB)
Più sensibile (fino a 2-10 mgl-1) e più specifico
dell’assorbimento chimico-fisico
1
SISTEMI E MECCANISMI
DI RESISTENZA A
METALLI PESANTI
NEI BATTERI
RESISTENZA BATTERICA ALL’ARSENICO:
In circa tutti i batteri Gram positivi e Gram negativi
OPERONE ars
arsR repressore
arsB pompa di membrana chemiosmotica
arsC arsenato riduttasi
Locus opzionali (co-occorrono):
arsA ATPasi intracellulare  arsAB pompa ATPasica
arsD corepressore
Altri enzimi coinvolti nel metabolismo dell’arsenico
ed accoppiati alla catena respiratoria:
Arsenito ossidasi periplasmatica (asoAB)
Arsenato riduttasi (arrAB)
Arsenico Metilasi
Arr1p o Acr1:
regolatore
Arsenite and arsenate transport in E. coli and S. cerevisiae. ArsC and Arr2p, the cytoplasmic arsenate reductases.
ArsB and Arr3p, the potential-driven membrane arsenite efflux proteins (in bacteria coupled with ArsA to form an
ATPase). GlpF and Fps1p, the glycerol transport proteins that also transport arsenite. Pit and Pho87p, the potentialcoupled phosphate (and arsenate) uptake transporters. PstB, PstC, PhoS, the three-component Pst ATP-coupled
phosphate (and arsenate) uptake system. Ycf1p, the As(III)-3 GSH adduct carrier that transports the adduct complex
into the yeast cell vacuole compartment, functioning as an ATPase. GSH, glutathione.
Fig. 4. Three families of evolutionarily related arsenate reductase sequences. Selected representatives of (A) the large Grx
plus GSH-using clade, including E. coli K12 and plasmid R773; (B) the unrelated Trx-using clade, including three
Staphylococcus plasmids, together with paralogous low molecular mass protein phosphotyrosine phosphatases (LMWPTPase) of bacterial and mammalian origin; and (C) the eukaryotic tree of yeast arsenate reductase Arr2p (NP015526), a
second yeast gene product, yeast enzyme rhodanase and two Cdc25A group large PTPases (only comparable lengths of
primary sequences were aligned). Reductase determinants for which there are phenotype data are shaded. Dashed lines
separate orthologous branches.
The proposed reaction mechanism pathways of ArsC arsenate
reductases from (A) plasmid R773 and (B) plasmid pI258. The figure
highlights the differences in proposed intermediates.
Messens, Silver, J. Mol. Biol. 2006
n.b.
Assente in
B.subtilis
Structures of Trx-coupled
arsenate reductase. (a) The
structure of reduced pI258 ArsC
(PDB code 1LJL) and oxidized
pI258 ArsC (PDB code 1JFV). The
active site P-loop is in red and the
three catalytic cysteine residues
are in stick presentation. Asn13
(red stick) of the P-loop
coordinates with potassium in the
cation-binding site. (b) The active
site of the Trx-coupled arsenate
reductases in stick presentation.
The P-loop of pI258 ArsC mutant
C15A (PDB code 1LJU) with a
covalent Cys10-S-AsHO3−
intermediate and the leaving (to be
protonated) hydroxyl (OH−) is
shown.
Structures of Grx-coupled
arsenate reductase. (a) Ribbon
diagram structure of reduced
R773 ArsC (PDB code 1I9D).
The single catalytic cysteine and
two essential arginine residues
are in stick presentation. (b) and
(c) The As(V)- (PDB code 1JZW)
and As(III)-bound (PDB code
1SJZ) active sites in stick
presentation. Covalent
intermediates with (b) arsenate,
(c) dihydroxy arsenite trapped in
the R60K mutant and (d)
monohydroxy positively charged
arsenite (PDB code 1J9B) are
shown.
Postulated reaction scheme of yeast ACR2p. The reaction scheme is similar to that of
plasmid R773 ArsC. (1) ACR2p with a Cys76 activated thiolate reacts with arsenate to form
a covalent As(V) intermediate. (2) Glutathione displaces a hydroxyl group to produce the
tertiary glutathionylated intermediate. (3) Grx reacts with GSH, As(V) is reduced to
As(III) and Grx-S-SG is released. (4) A postulated monohydroxy positively charged arsenite
intermediate is formed. (5) Arsenite is released and reduced ACR2p is regenerated. Cys106
and Cys119 are not known to have catalytic roles.Arg82 necessary for catalysis
Hypothesis of reaction mechanism of Synechocystis arsenate reductase. Cys80 and Cys82
form a disulphide bond and (1) the As(V)-enzyme intermediate is formed, then (2) attacked by
glutathione to form a cysteinyl-As(V)-glutathione intermediate. (3) Arsenate is reduced and
arsenite released; a disulphide forms between Cys8 and glutathione. Steps (4)–(6) represent a
modified version of the internal disulphide cascade that takes place in pI258 ArsC. (4) A
rearrangement transfers glutathione from Cys8 to Cys80 or Cys82. (5) Glutaredoxin attacks
the disulphide forming Grx-S-S-G. (6) A rearrangement restores active site Cys8 concomitant
with the Cys80-Cys82 disulphide.
arsA e arsD sono presenti nella cellula come omodimeri
arsD e arsA interagiscono fisicamente:
Debolmente in assenza di As(III)/Sb(III)
Fortemente in presenza di As(III)/Sb(III)
Le cisteine di arsD e arsA sono necessarie per l’interazione.
E’ arsA legata ad ATP che interagisce
L’interazione con arsD aumenta l’efficienza della pompa arsAB
(dimostrato mettendo E. coli trasformato con arsDAB e E. coli
trasformato con arsAB nella medesima coltura contenente
As(III); dopo una settimana sopravvive solo il primo)
Lin, Yang, Rosen Journal of Bioenergetics and Biomembranes 2007
arsD è un “metallochaperone”
arsD trasferisce Sb(III)/As(III) ad arsA, con
efficienza MgATP > MgADP
arsD ha maggiore affinità per il metallo di arsA, ma
l’equilibrio è spostato dall’estrusione del metallo da
parte di arsAB
MODELLI DI ARSENITO OSSIDASI E ARSENATO
RIDUTTASI RESPIRATORIE
cell surface arsenate reductases are
components of respiratory electron
transport chains in which arsenate is the
terminal electron acceptor for anaerobic
respiration
Struttura X-ray di Arsenito ossidasi respiratoria di A. faecalis
Eterodimero, ellis et al. Structure 2001
Azurin or
cytochrome c
The structure and proposed reaction cycle of arsenite oxidase. Reaction steps are (1) binding of arsenite, AsO 3H2−, to the
enzyme, (2) two-electron transfer to Mo, oxidizing As(III) to As(V) and reducing Mo(VI) to Mo(IV), (3) release of
arsenate, AsO4H2−, (4) two-electron transfer from Mo(IV) to 3Fe–4S center, regenerating Mo(IV) reaction center, (5) twoelectron transfer from 3Fe–4S center in large subunit to 2Fe–2S Rieske center of small subunit, and (6) electron transfer
from the 2Fe–2S center of arsenite oxidase to the respiratory chain to oxygen
METABOLISMO DELL’ARSENICO PROPOSTO PER
Alcaligenes faecalis
Arsenico metilasi procariotica (arsM)
SAM: S-adenosil metionina, donatore di gruppi metilici
Arsenite, arsenate, and antimonite resistance of
Halobacterium sp. strains NRC-1 (solid symbols)
and SK402 (open symbols). Growth with different
concentrations of sodium arsenite (A), sodium
arsenate (B) and antimony potassium tartrate (C)
is plotted. Original cultures of each single colony
from NRC-1 and SK402 were induced with 1 µM
arsenite and diluted 1:500 into fresh broth with
the indicated concentrations of As(III), As(V), or
Sb(III). Cell growth was monitored at OD600 for
14 days with incubation at 42°C and shaking at
200 rpm. and , no addition; and , 0.1 mM
arsenite (A), 10 mM arsenate (B), or 0.05 mM
antinomite (C); • and , 0.15 mM arsenite (A), 20
mM arsenate (B), or 0.1 mM antinomite (C).
SK402: arsADRC deletion
Maggiormente sensibile ad arsenito e antimonito
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=400623
2. RESISTENZA BATTERICA AL MERCURIO
E’ il meccanismo studiato per primo e meglio caratterizzato, è il
meccanismo di resistenza a ioni tossici più diffuso.
I geni coinvolti nella resistenza al Mercurio possono essere:
• Plasmidici: presenti in plasmidi coniugativi o trasposoni, spesso associati a
geni per la resistenza ad antibiotici [es:Un operone mer si trova nel
trasposone Tn21 (8kb), all’interno del plasmide R100 (94 kb), il primo
multidrug resistence plasmid isolato].
• Cromosomici: geni per la resistenza a composti organici contenenti
mercurio sono stati isolati in ceppi di Bacillus.
OPERONI mer
merR regolatore trascrizionale
merD corepressore
merT,P proteine coinvolte nel trasporto
dello ione Hg2+
mer C,F proteine di trasporto
alternative
merA riduttasi del mercurio
merB liasi organomercurica
presente in alcuni operoni mer
S. aureus, Bacillus
merG, E trovati in operoni mer ad ampio
spettro. merG potrebbe avere ruolo nel
bloccare alcuni organomercuriali
Nascimento & Chartone-Souza, GMR, 2003
RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DEI MECCANISMI
DI RESISTENZA A Hg IN BATTERI GRAM NEGATIVI
?
TRASPORTO DI Hg ALL’INTERNO DEL BATTERIO
• Non sono state identificate proteine per il trasporto di Hg attraverso la
membrana esterna.
• merP nel periplasma lega Hg col motivo Cys14-X-X-Cys17 presente in un
loop all’interno della struttura .
• merP trasferisce rapidamente Hg a 2 Cys di merT nella membrana interna
•merT è una proteina con 3 eliche transmembrana che trasporta Hg nel
citoplasma senza consumo di energia, probabilmente attraverso una coppia
di Cys sulla prima elica TM e una citoplasmatica.
• Hg viene trasferito alla coppia C14-C11 nel dominio di legame N-terminale
di merA, poi alla coppia C557-C558 e poi alla coppia C135-C140 nel sito
attivo
Il trasporto di Hg è mediato dal
trasferimento di Hg tra coppie di Cys.
STRUTTURA NMR DEL SITO DI LEGAME PER Hg IN
merP: LOOP CONTENENTE IL MOTIVO Cys14-X-X-Cys17
N-term
C-term
MECCANISMO DI REAZIONE DI merA:
flavoproteina contenente FAD
Reazione catalizzata da merA:
Hg(II) + NADPH + OH-  Hg(0) + NADP+ + H2O
TRASPORTO DI Hg E MECCANISMO DI REAZIONE IN merA:
L’interazione è stata dimostrata in vivo (Schue et al., Biometals, 2007), e non
dipende da Hg
STRUTTURA di merA
Space-filling model of Bacillus
sp. RC607 MerA. The main
pathway is shown for entry of
bulky Hg(SR)2 substrates via Cterminal cysteines and the
alternative pathway that small
non-physiological Hg(II)
substrates such as HgBr2 and
Hg(CN)2 can enter. The
alternative pathway is too small
for bulky Hg(SR)2 substrates,
so the segment must move out
of the way when the C-terminal
cysteines are absent in the
CCAA mutant.
merB: liasi organomercurica
Presente in alcuni plasmidi contenenti l’operone mer in E. coli, nel 50% di
Pseudomonas e in tutti i plasmidi “penicillinasi” di S.aureus.
Reazione catalizzata
da merB:
RHg+ + H+  Hg(II) + RH
In uno studio (Science, 2007) su composti modello, si è osservato che
anche tre tioli possono funzionare, il terzo come donatore di protone
STRUTTURA NMR DI merB
PARTICOLARE DELLE Cys COINVOLTE
NEL MECCANISMO DI REAZIONE
Una pianta di pioppo nero americano
transgenica che produce MerB
(destra) mette radici in terreni
contaminati con livelli di fenlimercurio
(fenilmercurio acetato, PMA, è stato
usato come disinfettante) che ne
inibiscono la crescita nella pianta wildtype (sinistra).
S. Lyyra et al., Plant Biotechnol. J. 5, 254 (2007).
Bioreattore per la
rimozione del Hg(II)
da acque reflue.
Il bioreattore riduce
Hg(II) a Hg(0) che
viene trattenuto dal
materiale di
impaccamento del
reattore in forma di
micro gocce
I. Wagner-Döbler, Appl.Microbiol.Biotechmol., 2003
I rimanenti meccanismi di resistenza a ioni inorganici tossici
sfruttano sistemi di efflusso.
POMPE DI MEMBRANA ATPasiche:
1. P-type ATPase: intermedio covalentemente fosforilato (ATP)
2. ABC ATPase: contengono un dominio legante ATP, generalmente
appartenente ad una subunità ATPasica citoplasmatica associata alla
membrana, non si formano intermedi fosforilati.
POMPE DI MEMBRANA CHEMIOSMOTICHE:
1. Major Facilitator Superfamily (MFS): polipeptide con 12-14 eliche TM
2. Cation Diffusion Facilitator family (CDF): i più rappresentativi sono
CzcD per Cd, Zn, Co
3. CBA family: complessi di antiporto chemiosmotico costituiti da un
etrotrimero formato da una subunità TM nella membrana interna, una
nella membrana esterna ed una periplasmatica che connette le due
subunità TM (es: CzcCBA)
4. ChrA: sistema di efflusso del cromato
5. ArsB: sistema di efflusso di arsenito [As(III)] e antimonito [Sb(III)]
P-type ATPase
• dominio N-term per legare metalli
• dominio per legare ATP
• 8 eliche TM che formano il canale per il trasferimento
Evoluzione delle P1B-type ATPases
Meccanismo catalitico generale