prove di spettroscopia d`immagine

“EARLY DETECTION” DI CONTAMINANTI FUNGINI TOSSIGENI
SU SEMI DI CEREALI E LORO PRODOTTI DERIVATI ATTRAVERSO
LA SPETTROSCOPIA DI IMMAGINE E ATTRAVERSO TECNICHE
MOLECOLARI
Antonella Del Fiore
FUNGHI AFLATOSSIGENI
APPARTENENTI QUASI ESCLUSIVAMENTE
AL GENERE ASPERGILLUS SEZ. FLAVI
Aspergillus flavus. Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius
 CONTAMINANTI PREFERENZIALI DI POST RACCOLTA
CONDIZIONI DI CRESCITA
Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus
T= 19-42°C
Topt=32°C
U= 15-30%
Aw minimo= 0,78
TOSSINOGENESI
T= 25-32°C Topt=28°C
Aw minimo= 0,85
ISOLATE PER LA PRIMA VOLTA DA A.FLAVUS (1963)
 COMPOSTI ETEROCICLICI ALTAMENTE OSSIGENATI
(Difurocumarociclopentenoni e difurocumarolattoni)
 ELEVATA ATTIVITA’ BIOLOGICA
17 AFLATOSSINE AD OGGI ISOLATE
 4 PRINCIPALI AFLATOSSINE
AFB1, AFB2, AFG1, AFG2
e
AFM1 (derivante dalla AB1)
CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE
 Basso peso molecolare
 Alto punto di fusione
 Stabilità alle alte temperature
 Scarsa idrosolubilità
 Fluorescenza naturale
FEGATO ORGANO BERSAGLIO PRINCIPALE
EPATOTOSSICITA’
IMMUNOTOSSICITA’, GENOTOSSICITÀ
AFM1
PROBABILE CANCEROGENICITA’
AGENTE CANCEROGENO GRUPPO 2
AFB1
EPATOCANCEROGENICITA’
AGENTE CANCEROGENO GRUPPO 1 (AIRC, 1993)
SOGLIA MASSIMA DI ASSUNZIONE CON LA DIETA
LIVELLO PIÙ BASSO POSSIBILE (AS LOW AS REASONABLE ACHIEVABLE, ALARA).
MATRICI AD ALTO TENORE IN CARBOIDRATI O LIPIDI
(SEMI OLEAGINOSI, SPEZIE, FRUTTA ESSICCATA E CEREALI)
MAIS CEREALE CONTAMINATO CON MAGGIORE FREQUENZA
FILIERA MAIDICOLA:
NEL 2003 GRAVE PROBLEMA DI CONTAMINAZIONE DA AFLATOSSINE
ELEVATO GRADO DI CONTAMINAZIONE
AFB1 IN GRANELLA DI MAIS
ELEVATO GRADO DI CONTAMINAZIONE
AFM1 IN LATTE E DERIVATI
CARRY OVER
Reg.to CE 1881/2006
“Tenori massimi di micotossine nei prodotti
alimentari”
METODI DI ANALISI UFFICIALI
AFLATOSSINE TOTALI
AOAC 991.31/97
AFLATOSSINA B1
ISTISAN n.10 09/06/1999
METODI CROMATOGRAFICI (HPLC)
SISTEMA DI RILEVAZIONE
FLUORIMETRICO
emissione = 440 nm)
INDIVIDUAZIONE PRECOCE DELLE SPECIE FUNGINE AFLATOSSIGENE
SVILUPPO DIUNA
METODICHE
ANALITICHE
IL “RILEVAMENTO
PRECOCE”ED
RAPPRESENTA
DELLE STRATEGIE
PIU’PER
EFFICACI
PER LA PREVENZIONE
DI FUNGHI
AFLATOSSIGENI
IL CONTROLLO DELLA
CONTAMINAZIONE
DA AFLATOSSINE
(Aspergillus spp. Sezione Flavi) IN MAIS
 MEDIANTE SPETTROSCOPIA D’IMMAGINE
 MEDIANTE PCR (CLASSICA E REAL-TIME q-PCR)
IBRIDO
CLASSE
FAO
Aw
DK 537
400
0,79
LATINA
600
0,64
DKC 6843
700
0,67
COSTANZA
600
0,66
CECILIA
500
0,65
DKC 5143
400
0,67
ARSANO
300
0,73
CORNIOLA
300
0,72
SIV 6450
500
0,85
DUENDE
600
0,77
NK CRISO
500
0,84
MITIC
600
0,87
IBRIDI DI MAIS
Zea mays L.
FARINE
COMMERCIALI
CARATTERIZZAZIONE DEGLI ISOLATI A LIVELLO DI SPECIE CON
CRITERI MORFOLOGICI E CON APPROCCIO SPETTRALE
TECNICA ANALITICA NON DISTRUTTIVA
TECNICA ANALITICA
SPETTROSCOPIA
IMAGING
COMBINATA
,
CARATTERIZZAZIONE
PROPRIETA’ DI “SUPERFICIE”
CARATTERIZZAZIONE
PROPRIETA’ SPETTRALI
TIPICA CONFIGURAZIONE DI UN
SISTEMA PER LA SPETTROSCOPIA
D’IMMAGINE
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
400
500
700
600
800
900
1000
Lunghezza d'onda (nm)
ROI 1
ROI 2
Pagina del software Spectral Scanner v. 2.0 DV s.r.l. (2003) per
l’acquisizione e l’elaborazione delle immagini di riflettanza
spettrale.
PROVE SPERIMENTALI
DESKTOP SPECTRAL SCANNER “IMSPECTOR V10”-SPECIMTM,
INTERVALLO SPETTRALE 400–1000 nm
ACQUISIZIONE ED ARCHIVIAZIONE IMMAGINE SPETTRALE DEL CAMPIONE
SELEZIONE SULL’IMMAGINE DELLA REGIONE DI INTERESSE (ROI)
ELABORAZIONE SPETTRI DI RIFLETTANZA PER TUTTI I PUNTI DELL’AREA SELEZIONATA
RIFLETTANZA RELATIVA DEL CAMPIONE: RAPPORTO, IN OGNI PUNTO TRA IMMAGINE
SPETTRALE DEL CAMPIONE E IMMAGINE SPETTRALE DEL BIANCO
ARTICOLAZIONE DELLE FASI DI RICERCA
1. ACQUISIZIONE ED ELABORAZIONE IMMAGINI SPETTRALI SPECIE FUNGINE
VERIFICARE SE IL METODO ANALITICO RENDE
POSSIBILE RILEVARE LA PRESENZA DI
2. ACQUISIZIONE ED ELABORAZIONE IMMAGINI SPETTRALI DA MAIS
FUNGHI AFLATOSSIGENI IN MAIS
SULLA BASE DI DIFFERENZE SPETTRALI
SIN DALLE PRIMISSIME FASI DELLA CONTAMINAZIONE
NON
CONTAMINATO
NATURALMENTE
CONTAMINATO
ARTIFICIALMENTE
CONTAMINATO
3. ELABORAZIONE STATISTICA DEI DATI SPETTRALI
ACQUISIZIONE IMMAGINI SPETTRALI
SPECIE FUNGINE CONTAMINANTI
DEL MAIS
A (log 1/R) norm
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
ACQUISIZIONE DELLE IMMAGINI
SPETTRALI DA MAIS
Spettri di assorbanza apparente ottenuti da inoculi su
PDA di differenti specie fungine
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
lunghezza d'onda (nm)
PROFILI
SPETTRALI DIFFERENTI
Aspergillus niger
Penicillium sp
Aspergillus
parasiticus
2999
graminearum
TRA SPECIE FUNGINE Fusarium
DIFFERENTI
Aspergillus flavus
Fusarium verticilloides
Spettri
registrati
dopo 7 giorni
di crescita a 30°C
PROFILI
SPETTRALI
DIFFERENTI
DI DIFFERENTI SPECIE FUNGINE
IBRIDI DI MAIS DIFFERENTI
CARATTERIZZATI DA UGUALE
PROFILO SPETTRALE
VALUTAZIONE DELL’ INFLUENZA SUL PROFILO SPETTRALE DEL MAIS DI:
 COLORAZIONE CARIOSSIDI
 MICROFLORA NATURALE CARIOSSIDI
 GRADO DI UMIDITA’ (UA) DELLE CARIOSSIDI
DIFFERENZE SPETTRALI SIGNIFICATIVE
TRA MAIS AD ELEVATA DIFFERENZA DI
COLORAZIONE (CECILIA/RED)
(ANOVA -Fisher’s LSD test )
CECILIA
CORNIOLA RED
INDIPENDENZA DEL SEGNALE SPETTRALE
dalla microflora naturale delle cariossidi
 dal grado di umidita’ (UA) delle carIossidi
FIRMA SPETTRALE
“UNICA” DEL MAIS
ANALISI DELLE VARIAZIONI SPETTRALI
DETERMINATE DALLO SVILUPPO FUNGINO SULLA SUPERFICIE DEL MAIS
ATTRAVERSO
ACQUISIZIONE ED
ANALISI SPETTRI DI
MAIS CONTAMINATO
ARTIFICIALMENTE IN
CONDIZIONI DI
INOCULO
CONTROLLATO
1,8
1,4
A.niger
1,0
0,6
A.flavus
0,2
-0,2
-0,6
-1,0
-1,4
400
24 h
72h
MAIS C.V.
CECILIA
30% UA, 0,99 AW
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
INOCULO SOSPENSIONE CONIDICA FUNGHI
(100 conidi *g-1 mais)
ACQUISIZIONE GIORNALIERA
Dt 10 GIORNI
950
1000
Spettri medi di assorbanza apparente di mais inoculato con singole specie fungine a 1, 2, 3 e 7 giorni dall’inoculo su mais.
Spettri medi di assorbanza apparentedi mais inoculato con singole specie fungine, a 1, 2, 3 e 7 giorni dall’inoculo su mais.
DUE INTERVALLI
DIiLUNGHEZZA
D’ONDA,
e 850-950
nmtestate
(Pearson et al., 2006)
RISULTATI
Per tutti
campioni analizzati,
e per500-700
tutte lenm
specie
fungine
Mais inoculato con Aspergillus flavus
1,6
0,8
0,0
2,4
2,4
A (log 1/R) norm
A (log 1/R) norm
A (log1/R) norm
2,4
1,6
0,8
0,0
 (nm)
1g
2g
1,6
0,8
0,0
-0,8
500 525 550 575 600 625 650 675 700
-0,8
500 525 550 575 600 625 650 675 700
-0,8
500 525 550 575 600 625 650 675 700
Bianco
Mais inoculato con Aspergillus niger
Mais inoculato con Aspergillus parasiticus
(nm)
(nm)
3g
7g
Bianco
1g
2g
3g
Bianco
7g
1g
2g
3g
7g
D 500-700 nm: ASSORBANZA MAIS INOCULATO > RISPETTO AL MAIS NON INOCULATO
Mais inoculato con Aspergillus flavus
-0,6
-1,0
875
900
925
950
-0,2
-0,2
A (log 1/R) norm
A (log 1/R) norm
A (log1/R) norm
-0,2
-1,4
850
-0,6
-1,0
-1,4
850
875
900
(nm)
Bianco
1g
2g
Mais inoculato con Aspergillus niger
Mais inoculato con Aspergillus parasiticus
925
950
-0,6
-1,0
-1,4
850
875
(nm)
3g
7g
Bianco
1g
2g
900
925
950
(nm)
3g
7g
Bianco
1g
2g
D 850-950 nm: ASSORBANZA MAIS INOCULATO < RISPETTO AL MAIS NON INOCULATO
3g
7g
Variazioni spettrali
in mais contaminato
con Aspergillus niger
535 nm
maggiori rispetto
a quello contaminato
con Aspergillus flavus
e Aspergillus
parasiticus
Andamento
caratteristico
mais inoculato
con Aspergillus niger
con punto di flesso
a 535 nm
Spettri medi di assorbanza apparente di mais inoculato con differenti specie fungine
registrati a 3 giorni dall’inoculo su mais
ELABORAZIONE STATISTICA DEI DATI SPETTRALI
DIFFERENZE SPETTTRALI STATISTICAMENTE SIGNIFICATIVE TRA IL MAIS NON
CONTAMINATO ED IL MAIS CONTAMINATO CON ASPERGILLUS FLAVUS A PARTIRE DA:
72 h di infezione (PCA+ DA, livello di confidenza del 95%)
48 h di infezione a  410 nm e 470 nm
(PCA+ ANOVA, Fisher’s LSD test, livello di confidenza del 95%)
Il metodo permette
di rilevare la presenza di
Aspergillus flavus a 48 h dall’inoculo su mais,
prima che il fungo
diventi evidente ad osservazione visiva
METODO ANALITICO BASATO SULLA SPETTROSCOPIA D’IMMAGINE
METODO RAPIDO E SUFFICIENTEMENTE SENSIBILE
PERMETTE DI RILEVARE LA CONTAMINAZIONE FUNGINA A 48 h dall’infezione
 UTILIZZABILE COME METODO DI RICONOSCIMENTO FUNGINO
“SPECTRAL MATCHING” TRA SPECIE FUNGINE CON PROFILI SPETTRALI NOTI E SPECIE FUNGINE
INCOGNITE
SVILUPPATE METODICHE BIOMOLECOLARI BASATE SULLA PCR
PER IL RILEVAMENTO DI FUNGHI AFLATOSSIGENI
 Metodica semiquantitativa basata sulla PCR CLASSICA
 Metodica quantitativa basata sulla REAL-TIME qPCR
IMPIEGO DI MARCATORI MOLECOLARI SPECIFICI
GENI TARGET
COINVOLTI NELLA VIA
BIOSINTETICA DELLE AFLATOSSINE
PERMETTONO DI RILEVARE LA PRESENZA
DI SPECIE FUNGINE
POTENZIALMENTE AFLATOSSIGENE
Afl R
Afl M
Afl P
SVILUPPO DEL METODO MOLECOLARE
”PCR E REAL TIME qPCR”
1.
SVILUPPO DEL PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE CON DNA FUNGINO PURO
VALUTAZIONE DELLA SPECIFICITA’ E DELLA SENSIBILITA’ DEL METODO
SENSIBILITA’
SPECIFICITA’
“Quantita’ minima di DNA fungino rilevabile”
Verificata testando la coppia di primer
2. VERIFICA
DELLA
SPECIFICITA’,
SENSIBILITA’
E
FATTIBILITA’
DEL
METODO con
SU MATRICE
REALE
Determinata
amplificando
i primer selezionati
scelta per l’amplificazione
diluizioni seriali di DNA genomico della specie fungina
del frammento genico di interesse con DNA
di interesse
estratto da differenti specie fungine
Curva standard per analisi semiquantitativa
2.a.
DNA TOTALE ESTRATTO DA MATRICE
CONTAMINATA ARTIFICIALMENTE
IN CONDIZIONI DI INOCULO CONTROLLATO
2.b. DNA TOTALE ESTRATTO DA MATRICE
NATURALMENTE CONTAMINATA
VERIFICA DELLE
PROPRIETA’
DIDNA
“EARLY
DETECTION”
Amplificazione
PCR di
estratto,
DEL
METODO
a tempi differenti di infezione, da matrice
DETERMINAZIONE
DELLA
CAPACITA’ DEL METODO
contaminata
artificialmente
DI MONITORARE LO SVILUPPO DEL FUNGO SU MATRICE E
con inoculo minimo di una sospensione
PERMETTERNE LA RILEVAZIONE FIN DALLE PRIME FASI
conidica
fungo di interesse
DELLAdel
CONTAMINAZIONE
APPLICAZIONE DEL PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE
A MATRICE NON CONTAMINATA ARTIFICIALMENTE
(MATRICE T.Q)
CONFERMA DELLA EFFICACIA DEL METODO
ATRAVERSO PROVE DI ISOLAMENTO MICOTICO TRADIZIONALI
VERIFICATA SOTTOPONENDO AD AMPLIFICAZIONE PER PCR DNA ESTRATTO DA:
FUNGHI ASPERGILLUS SEZIONE FLAVI
(Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus)
ALTRI FUNGHI ASPERGILLUS
(Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger)
FUNGHI NON ASPERGILLUS
(Fusarium sp., Rhizopus sp.)
BIOMASSE FUNGINE MISTE
A. flavus A. parasiticus
3357
2999
AMPLIFICAZIONE ESCLUSIVA
CON DNA DI A. FLAVUS E A. PARASITICUS
Gel Agarosio 1%
PCR di DNA estratto da micelio fungino da colture pure
CURVA STANDARD
DNA GENOMICO DI A.FLAVUS 3357
MONITORAGGIO DELLO SVILUPPO DI A. FLAVUS SU MAIS
5
Curva di calibrazione primer afl P
GENE TARGET Afl M
4
R
3
2
INTERVALLO
y = 0.3409ln(x) + 1.0795
(100 ng-5pg)
R² = 0.9257
1
LIMITE DI RILEVABILITA’:
12 h dopo inoculo con 100 conidi
0
-1
0
20
40
60
80
100
120
ng DNA
QUANTITA’
MINIMA
RILEVABILE DI
DNA DI
A.FLAVUS
10 pg
IL METODO PERMETTE QUINDI IL
IL FUNGO A 12 h DALL’INOCULO SU MAIS
RILEVAMENTO “PRECOCE” DI ASPERGILLUS FLAVUS
NON E’ ANCORA RILEVABILE AD OSSERVAZIONE ALLO
SU MAIS
STEREOMICROSOPIO
SVILUPPATO UN METODO PER IL
RILEVAMENTO QUANTITATIVO DI FUNGHI ASPERGILLUS spp. SEZIONE
FLAVI SU MAIS ATTRAVERSO REAL-TIME qPCR
(Colorante Sybr-green)
Gene target: Afl R
Frammento amplificato: 352 bp
AMPLIFICAZIONE SEQUENZA
TARGET E CONTEMPORANEA
QUANTIFICAZIONE PER MEZZO DI UN
DETECTOR A FLUORESCENZA
IDENTIFICAZIONE CERTA DELLA
SEQUENZA TARGET RISPETTO A PRODOTTI
ASPECIFICI
(Curve di melting)
CURVA STANDARD
DNA PLASMIDICO A. FLAVUS
Gene target Afl R
DILUIZIONI SERIALI
STANDARD DNA
PLASMIDICO GENE aflR
INTERVALLO
(106-10-3) pg,
QUANTITA’
MINIMA DNA
FUNGINO
RILEVABILE
MONITORAGGIO DELLO SVILUPPO
FUNGINO SU MAIS
DNA
DNA
LIMITE DI RILEVABILITA’
6h
IL DNA FUNGINO SU MAIS E’ RILEVATO E
QUANTIFICATO DOPO SOLE 6 h DALL’INOCULO
RISPETTO ALLE 12 h DELLA PCR CLASSICA
10-3 pg

IL METODO PERMETTE DI RILEVARE QUANTITA’ DI DNA DI FUNGHI
AFLATOSSIGENI 104 VOLTE INFERIORI A QUELLE DELLA PCR TRADIZIONALE
DETERMINAZIONE E QUANTIFICAZIONE DI DNA DI ASPERGILLUS
CONFERMA
DELEMETODO
SU MATRICE
NATURALMENTE
FLAVUS IN MAIS
FARINE COMMERCIALI
NON
CONTAMINATI
ARTIFICIALMENTE
CONTAMINATA
CAMPIONI
Min: (0,122 pg/gmais)
LATINA
Max: (180297pg/g mais)
SIV 6450
180297 pg/g.mais
DNA
(pg/g.mais)
mg
mic.
89,45±0,27
<0,001
DK 537
494,65±0,16
0,007
DKC 6843
0,122±0,007
<0,001
ARSANO
10,95±0,20
<0,001
COSTANZA
28,23±0,27
<0,001
CECILIA
13,70±0,18
<0,001
NK-CRISO
175,64±0,25
0,001
CORNIOLA
7,75±0,12
<0,001
DUENDE
293,65±0,37
<0,007
DKC 5143
46,59±0,22
<0,001
SIV 6450
180297±248,55
4,12
MITIC
DK 537
MITIC
63900±77,78
1,87
CONTROLLO (CECILIA)
nd
nd
FARINA
1
63900
pg/g.mais
<0,001
494,65 pg/g.mais
70,96±0,35
FARINA 2
79,37±0,29
<0,001
FARINA 3
104,08±0,68
<0,001
DKC 6843
< 0,001mg micelio
SIV 64 50
4,12 mg micelio
FARINA 3
104,08 pg/g.farina
FARINA 4 MICELIO A.
5,43±0,20
nd
SVILUPPO EVIDENTE
FLAVUS DOPO
4 GIORNI
SU IBRIDI A PIU’ ALTA CONCENTRAZIONE IN DNA FUNGINO
GLI IBRIDI A MINORE CONCENTRAZIONE
DI DNA FUNGINO NON HANNO INVECE EVIDENZIATO SVILUPPO DI
A.FLAVUS NEI PRIMI 7 GIORNI
DKC 6843
METODO DI “EARLY DETECTION” MOLECOLARE
ELEVATA SPECIFICITA’ E SENSIBILITA’
METODICA SEMIQUANTITATIVA MEDIANTE PCR CLASSICA “Primer per afl P e afl M”
 rilevabilità della contaminazione da Aspergillus flavus dopo 12 h
 METODICA QUANTITATIVA MEDIANTE REAL-TIME qPCR “Primer per afl R”
 rilevabilità della contaminazione da Aspergillus flavus dopo 6 h
METODI ANALITICI AFFIDABILI E SENSIBILI
RILEVAZIONE PRECOCE DI BASSI LIVELLI DI CONTAMINAZIONE FUNGINA
RAPIDITA’ DI ESECUZIONE
SVILUPPO DI SISTEMI PORTATILI O AUTOMATIZZATI PER DETERMINAZONI “IN
SITU”O ON-LINE (SPETTROSCOPIA D’IMMAGINE)
RIDUZIONE DELL’IMMISSIONE NELLE FILIERE AGROALIMENTARI DI SOSTANZE
CARCINOGENE