PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO

ISOLAMENTO degli ACIDI NUCLEICI
AVVERTENZE:

Utilizzare tessuti freschi o correttamente conservati

Evitare di agitare fortemente o di pipettare
La QUALITA’ del materiale di partenza influenza la
qualità e la resa del DNA isolato


Molecole grandi di DNA sono facilmente danneggiate
dalle forze frizionali

Lavorare in sterilità per prevenire contaminazioni da nucleasi
 Autoclavare soluzioni e strumenti
alle soluzioni EDTA per chelare gli ioni Mg2+
 Aggiungere
necessari per l’attività delle DNasi

 Trattare materiali e soluzioni con DEPC per inibire le RNasi
...ISOLAMENTO degli ACIDI NUCLEICI
PROCEDURA:


Rottura dei tessuti (mortaio e pestello, omogeneizzatori…)


Trattamenti con RNasi e DNasi
Digestione enzimatica della parete cellulare e lisi della membrana
plasmatica
Deproteinizzazione mediante soluzioni acquose di fenolo/cloroformio
Le proteine denaturate rimangono all’interfaccia fra la fase organica e
quella acquosa


Precipitazione con etanolo o isopropanolo
Conservazione a -20°C/-80°C in un tampone contenente EDTA
Il DNA è soggetto a idrolisi acida se conservato in acqua
CARATTERIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA
CONCENTRAZIONE:


Misurazione dell’assorbimento a 260 nm
A260 = 1 OD
[DNA]= 50 mg/ml
A260 = 1 OD
[RNA]= 40 mg/ml
PUREZZA:
Rapporto A260/A280
A260/A280 = 1.7/1.9 (DNA)
A260/A280 = 1.9/2.1 (RNA)


Le misure spettrofotometriche non differenziano fra DNA ed RNA
Il fenolo ha un massimo di assorbimento a 270-275 nm
CONTROLLO INTEGRITA’ e TAGLIA
Elettroforesi su gel di agarosio
M
1
2
3
4
5
6
7
8
M
Kb
97.0
48.5
M: Markers
1: Sangue
2: Cellule HeLa
3: Cellule CHO
4: E. coli
5: B. subtilis
6: Coda di topo
7: Fegato
8: S S. cerevisiae
1
2
3
28 S
26 S
4
5
25 S
23 S
18 S
16 S
18 S
1: Topo
2: Uomo
3: Lievito
4: Batterio
5: Pianta
ISOLAMENTO mRNA
TTT
TTTTT
.....
Oligo dT-cellulosa
L’mRNA con poli(A) si
ibrida con l’oligo(dT)
AAA
AAA
AAAA
RNA cellulare totale
..
.
AAA
TTT
TTTTT
AAAA
Solo gli mRNA possiedono code di poli(A) lunghe 30150 residui.
Le sequenze di oligo(dT) sono immobilizzate su
supporti solidi, generalmente di cellulosa.
L’RNA viene denaturato e quindi applicato alla colonna
in una soluzione salina concentrata (NaCl 0.5 M).
NaCl 100 mM
Si effettuano molti lavaggi con una soluzione salina
meno concentrata (NaCl 100 mM) per rendere più
selettivo il legame tra RNA e oligo(dT).
.. .
.
TRIS 10 mM
EDTA 1 mM
Viene eluito
l’mRNA
L’rRNA ed il tRNA vengono eluiti
.....
AAA
AAA
AAA
AAAAA
AAA
AAA
AAAA
Aggiungendo una soluzione di TRIDS/EDTA si
recupera l’mRNA legato alla colonna.
STRUTTURA degli ACIDI NUCLEICI
ANALISI FISICA
Maggiore è G+C, maggiore è Tm.
1.2
50
1.1
1.0
40
60
Tm
80
Temperatura (°C)
0
100
Grado di denaturazione (%)
Temperatura di melting (Tm):
Temperatura in corrispondenza
della quale il DNA è denaturato
al 50%.
1.3
Assorbanza a 260 nm
Effetto ipercromico:
Aumento dell’A260nm durante il
processo di denaturazione del
DNA.
Curva di fusione
CINETICA di RINATURAZIONE
Curva C0t
Effetto ipocromico:
0
Diminuzione dell’A260nm durante il processo
di rinaturazione del DNA.
1) C0
2) Tempo
Concentrazione espressa in
nucleotidi/unità di volume
Rinaturazione (%)
Parametri che influenzano la
rinaturazione:
DNA a
rinaturazione
rapida
50
DNA a
rinaturazione
lenta
100
La misura della velocità di rinaturazione
può fornire utili informazioni circa la
complessità del DNA
-2
-1
0
1
2
Log Cot
3
4
5
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di
ISOLARE
AMPLIFICARE
frammenti di DNA
SEQUENZIARE
Perché manipolare i geni?
1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della
regolazione fisiologica;
2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la
sovraespressione;
3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle
proteine;
4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con
particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini
proteici
PROCEDURA di CLONAGGIO
ISOLAMENTO del gene
INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO
INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE
VIVENTI per propagarlo
Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell’unione di sequenze
di DNA in modo preciso….
…..tutto ciò si ottiene con l’ausilio di ENZIMI

ENDONUCLEASI
di
RESTRIZIONE
Sono enzimi che tagliano entrambi i filamenti della doppia elica
del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze.
Riconoscono SEQUENZE PALINDROMICHE di 4 o 6 nucleotidi
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
Entrambe le catene hanno la stessa sequenza
se lette in direzione 5’3’
Si distinguono in due classi:
Enzimi di CLASSE I
Tagliano il DNA in siti adiacenti alla sequenza
riconosciuta
Enzimi di CLASSE II
Tagliano il DNA all’interno della sequenza
riconosciuta

...ENDONUCLEASI
di
RESTRIZIONE
Possono lasciare estremità:
TRONCHE (o blunt) se il taglio cade al centro della sequenza
riconosciuta
HpaI
5’-GTTAAC-3’
3’-CAATTG-5’
5’-GTT
3’-CAA
AAC-3’
TTG-5’
SPORGENTI (o 5’/3’ protruding) dette anche ADESIVE (o
sticky) se il taglio avviene a posizioni sfalsate
sui due filamenti
BamHI
5’-GGATCC-3’
3’-CCTAGG-5’
5’-G
GATCC-3’
3’-CCTAG
G-5’
MAPPATURA di RESTRIZIONE
E’ il processo di determinazione delle posizioni dei siti di taglio delle
endonucleasi di restrizione all’interno di un pezzo di DNA.
IMPIEGHI COMUNI:

Distinzione di molecole di DNA della stessa lunghezza, ma con sequenze
diverse senza doverle sequenziare.

Individuazione di mutazioni geniche responsabili di malattie genetiche.

Identificazione di un frammento di interesse da un digerito in base al
suo peso molecolare.
...MAPPATURA di RESTRIZIONE
TRATTAMENTO
Nessuna digestione
Enzima A
DIMENSIONE dei
FRAMMENTI (Kb)
INTERPRETAZIONE
9
9
A
2+7
2
7
A B
Enzima B
3
3+6
6
B
A
3
6
A
B
1+2+6
2
Enzima A+ B
1
B
A
2+3+4
2
4
6
3
IDENTIFICAZIONE del FRAMMENTO di INTERESSE
mediante Southern blotting
M
1
1 2 3 4 5
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M
1
2
3
4
5
6
Markers
pBlueStar
XbaI/SstI
XbaI
BamHI/XbaI
NcoI/XbaI
NcoI
7
8
9
10
11
12
SstI/NcoI
HinDIII
NcoI/HinDIII
NcoI
NdeI/NcoI
BamHI/NcoI
6 7 8
9 10 11 12
DNA LIGASI
Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5’ di una estremità
ed il gruppo ossidrilico 3’ della catena adiacente.
L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi perché stabile e poco costosa.



CARATTERISTICHE DELLA REAZIONE:
Presenza di ATP
10° C o.n. oppure temperatura ambiente, poche ore
La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendo l’energia cinetica delle
molecole, riduce la possibilità che le estremità appaiate si separino prima di venir
stabilizzate dalla ligazione.
BamHI
OH
P
5’-G
AATTC-3’
3’-CTTAA
G-5’
OH
P
OH
OH
EcoRI
OH
P
5’-G
GATCC-3’
3’-CCTAG
G-5’
P
P
OH
P
OH
P
OH
P
DNA LIGASI
5’-GTT
3’-CAA
P
OH
P
AAC-3’
TTG-5’
P
OH
OH
P
OH
OH
P
OH
P
BamHI
P
OH
OH
OH
P
OH
HpaI
P
FOSFATASI ALCALINA
OH
OH
OH
OH
Blunt ends ligation
oppure trattamento con
Transferasi terminale
P
OH
P
+ dATP
Sticky ends ligation
P
AAA
AAA
P
TTT
OH
OH
+ dTTP
P
OH
OH
P
OH
5’-G
GATCC-3’
3’-CCTAG
G-5’
TTT
Sticky ends
ligation
P
DNA LIGASI
EcoRI
BamHI
OH
P
5’-G
GATCC-3’
3’-CCTAG
G-5’
OH
P
OH
P
OH
P
5’-G
AATTC-3’
3’-CTTAA
G-5’
NUCLEASI S1
P
OH
OH
OH
P
P
P
OH
blunt ends ligation
oppure
legame con un linker
P
OH
EcoRI
OH
P
+
P -GGAATTCC
CCTTAAGG- P
digestione
OH
P
OH
P
P
OH
P
sticky ends ligation
OH
PLASMIDI

Piccole molecole di DNA batterico extracromosomico,
circolare.

In natura conferiscono vantaggi selettivi ai ceppi che
li contengono.

Ingegnerizzati per l’uso di laboratorio.
Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide
deve avere:
 Dimensioni contenute

Un sito di origine della replicazione di tipo
batterico controllato in maniera “rilassata”
o “stringente”
geni che conferiscono resistenza a due
 Due
antibiotici
 Siti unici di restrizione
TRASFORMAZIONE delle CELLULE BATTTERICHE
METODO CHIMICO
METODO ELETTRICO
Le cellule sono rese COMPETENTI mediante:
trattamento a freddo con ioni Ca2+
trattamento a freddo con glicerolo
Il DNA viene incorporato mediante:
SHOCK TERMICO
IMPULSO di CORRENTE
ELETTRICA
PIASTRAMENTO SU TERRENO SELETTIVO
Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide formeranno delle colonie.
Quelle che hanno incorporato il plasmide con l’inserto possono
essere individuate grazie alla perdita di una funzione metabolica
INATTIVAZIONE INSERZIONALE
ANALISI dei PLASMIDI RICOMBINANTI
PIASTRAMENTO PER REPLICA
Tampone di velluto
Pistramento per replica
    
Colonie sviluppatesi su
terreno contenente
ampicillina
Incubazione
Piastra con terreno
contenente tetraciclina
 
Crescono solo le cellule
contenenti il plasmide
privo dell’inserto
Recupero delle colonie contenenti
il plasmide ricombinante dalle
piastre con ampicillina
…ANALISI dei PLASMIDI RICOMBINANTI
SCREENING BLU/BIANCO
lacZ
gene che codifica per la b-galattosidasi
interrotto dal sito di clonaggio multiplo (pcs)
L’enzima b-galattosidasi è in grado di metabolizzare il substrato
incolore X-Gal formando un composto di colore blu.
Un ceppo batterico lac-, trasformato con il plasmide ricombinante
pUC19, è in grado di metabolizzare il substrato X-Gal solo se il
plasmide è privo dell’inserto e forma colonie di colore blu.
Colonie di batteri lac+ che contengono plasmidi senza inserto
Colonie di batteri lac- che contengono plasmidi ricombinanti
Piastra con terreno
contenente X-Gal
pcs
Curva di crescita di E. coli
INTERVALLO (Lag phase)
4 - 5 ore
FASE LOGARITMICA
I batteri crescono esponenzialmente.
10 - 11 ore
5.0
Densità cellulare (OD600)
I batteri vengono diluiti nella coltura
iniziale; la divisione procede lentamente
in quanto le cellule si stanno adattando
al terreno fresco.
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0
5
10
15
Tempo (h)
FASE STAZIONARIA
La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una
fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.
20
PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
LISI ALCALINA
1. RISOSPENSIONE
3. NEUTRALIZZAZIONE
KAc
E. coli
NaOH / SDS
RNasi
Centrifugazione
2. LISI
Supernatante
contenente il
DNA plasmidico
DNA cromosomico
DNA plasmidico
Precipitato
contenente DNA
genomico,
proteine, detriti
cellulari
...PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
ULTRACENTRIFUGAZIONE in gradiente di densita’ di CsCl in presenza di EtBr
DNA cromosomico
Bromuro d’etidio
Svolgimento della doppia elica e
diminuzione della densità idrodinamica
DNA plasmidico
Bromuro d’etidio
Svolgimento della doppia elica compensato
dall’introduzione di supereliche
Il superavvolgimento indotto nel DNA plasmidico dall’intercalazione del bromuro
d’etidio fra le basi ne impedisce progressivamente il legame rendendo la densità
idrodinamica del DNA plasmidico maggiore di quella del DNA cromosomico.
VETTORI di ESPRESSIONE
CLONARE

OTTENERE NUMEROSE COPIE IDENTICHE
di un certo frammento di DNA
MA,
CLONARE IN UN VETTORE
DI ESPRESSIONE

OTTENERE DISCRETE QUANTITÀ
del PRODOTTO PROTEICO codificato
dal gene di interesse
INSULINA
ORMONE DELLA CRESCITA UMANO
INTERFERONI
sono solo pochi esempi di proteine
commercializzate prodotte da batteri
...VETTORI di ESPRESSIONE
PROPRIETA’:
Oltre alle normali caratteristiche di un vettore di clonaggio,
un vettore per l’espressione di geni in cellule batteriche
DEVE POSSEDERE:
SEQUENZA PROMOTRICE
SEQUENZA SHINE-DALGARNO

a monte di uno o più siti di
inserzione del DNA estraneo
AVVERTENZE:
UTILIZZARE il cDNA
CLONARE il cDNA nella CORRETTA CORNICE di LETTURA
CONSIDERAZIONI:
I batteri non sono in grado di eseguire modificazioni
post-traduzionali
ESPRESSIONE di GENI ETEROLOGHI in sistemi batterici
Alcuni ceppi ospite sono stati opportunamente ingegnerizzati per
l’espressione regolata dei geni.
IPTG
Per esempio, viene
spesso usato un
sistema che
accoppia al sistema
lac di E. coli una
RNA polimerasi di
batteriofago.
IPTG
E. coli RNA
polimerasi
T7 RNA
polimerasi
T7 gene 1
promotore
lac
DE3
T7 RNA
polimerasi
gene target
lac o
promotore lac o
T7
repressore
lac
gene
lac I
repressore
lac
pET
gene
lac I
genoma di
E. coli
CELLULA OSPITE
PLASMIDI per la TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE
Derivano da modificazioni del plasmide naturale Ti (Tumor inducing) del batterio
del suolo A. tumefaciens che trasforma geneticamente le piante con un processo
che rientra normalmente nel suo ciclo vitale.
Citichinina
STRATEGIA:
Sostituire i geni che causano il tumore con
il gene di interesse, lasciando intatti i
confini dx e sx necessari all’integrazione
del DNA nel genoma della pianta.
Introdurre nel plasmidio:



Auxina
T-DNA
Opina
Confine
destro
Confine
sinistro
Plasmide Ti
Geni vir
un gene marcatore selezionabile, sia vegetale che batterico;
un’origine di replicazione che consenta al plasmidio di duplicarsi in E. coli ;
un sito di clonaggio multiplo compreso fra i confini dx e sx.
Catabolismo
dell’opina
ori
...PLASMIDI per la TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE
SISTEMA VETTORE BINARIO
Gene bersaglio
Gene marcatore
selezionabile vegetale
Confine
destro
Confine
sinistro
Vettore binario
E. coli
ori
SISTEMA VETTORE COINTEGRATO
Gene marcatore
per E. coli e A.
tumefaciens
A. tumefaciens
ori
Confine
destro
Gene marcatore
selezionabile
vegetale
Gene marcatore per E.
coli e A. tumefaciens
Vettore
cointegrato
Gene bersaglio
RICOMBINAZIONE
Sequenza DNA omologa
Confine
sinistro
Un plasmide Ti modificato contenuto in
A. tumefaciens reca i geni vir,
indispensabili all’integrazione del DNA
E. coli ori
Geni vir
Plasmide Ti
disarmato
compreso fra i confini dx e sx nel genoma
della pianta.
A. tumefaciens ori
TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE
 Trasformazione mediata da A. tumefaciens
Il nuovo plasmide entra nelle
cellule dal bordo del ritaglio
Dischetti di foglie poste su una
sospensione di cellule di
Agrobacterium
Dischetti di foglie cresciute su un
terreno nutriente selettivo; solo le
cellule trasformate si moltiplicano
Vengono riprodotte intere
piante contenenti il gene
introdotto
 Elettroporazione

Alto voltaggio
protoplasti
 Bombardamento con microproiettili
➺
➺
➺
➺
➺
➺
➺
Microproiettili di oro o tungsteno rivestiti di DNA plasmidico
OLTRE AI PLASMIDI...
I plasmidi sono i vettori di elezione per clonare piccoli
frammenti di DNA (5-10 Kb).
INFATTI,
 Plasmidi di grandi dimensioni sono instabili e possono andare
incontro a delezioni spontanee.
 La trasformazione non avviene efficentemente.
QUINDI,
Per clonare frammenti più grandi si impiegano come vettori del DNA
dei batteriofagi (virus batterici)che consentono di iniettare grosse
molecole di DNA nelle cellule batteriche per infezione.
VETTORI FAGICI
VETTORI COSMIDICI
DNA VIRALE come VETTORE DI CLONAGGIO
Un vettore comunemente utilizzato è il batteriofago l, lungo 49 Kb.
Eliminazione del DNA
non essenziale
DNA virale
Regione non essenziale
(circa 20 Kb)
DNA ricombinante
DNA da
clonare
Assemblaggio in vitro
delle particelle virali
Teste e code
del virus
Il DNA virale entra nelle cellule, viene
replicato e dirige la sintesi delle proteine
virali. La lisi delle cellule rilascia le nuove
particelle virali assemblate
Infezione
dei batteri
Recupero delle particelle virali e
isolamento del DNA clonato
COSMIDI
Sono PLASMIDI,
ma contengono, oltre alle caratteristiche
essenziali di un plasmide, anche un
SITO COS
La presenza di questo elemento è determinante per consentire
l’inserimento della molecola di DNA ricombinante nella testa del virus
che, a sua volta, la inietta in una cellula batterica per infezione.
IMPACCHETTAMENTO del DNA VIRALE
Estremità
coesive
Estremità
coesive
Sito cos
All’interno della cellula, le
estremità si appaiano
originando una molecola di
DNA circolare
Il DNA virale a doppia elica entra
nelle cellule batteriche durante
l’infezione come molecola lineare
Cicli ripetuti di replicazione
con il meccanismo del
cerchio rotante
Concatameri di copie di DNA virale
Il DNA viene inserito nelle
teste del virus e tagliato
a livello del sito cos
•
Il DNA codifica per le
proteine della testa e
della coda del virus
Sono aggiunte
le code
Particella virale infettiva.
I virus sono rilasciati per lisi delle cellule e
possono infettare altre cellule batteriche.
5’
VETTORI COSMIDICI
Sito cos
Gene per la
resistenza
all’antibiotico
ori
Sito di restrizione
DNA da
clonare
Taglio del plasmide e del DNA da clonare
con lo stesso enzima di restrizione
Ligasi (i frammenti sono
inseriti a caso fra due cosmidi)
Impacchettamento in vitro solo se la distanza
fra i due siti cos è compresa fra 37 e 52 Kb
Infezione di E. coli con i fagi e selezione delle colonie resistenti all’antibiotico
Batterio
Il DNA ricircolarizza attraverso i siti cos e viene
replicato all’interno del batterio come un plasmide
COSTRUZIONE BIBLIOTECHE GENOMICHE
PROCEDURA:
Isolamento del DNA genomico
Restrizione parziale con un enzima che riconosca
sequenze tetranucleotidiche
Frammenti di 10-40 Kb
Clonaggio in un vettore

Bisogna produrre un numero discreto di cloni per far sì che ogni
singolo gene sia presente almeno in un clone.
Per il clonaggio di frammenti di centinaia di migliaia di basi si utilizzano
come vettori i cromosomi artificiali di lievito.
CROMOSOMI ARTIFICIALI di LIEVITO
Caratteristiche dei plasmidi:
 Origine di replicazione autonoma
 Geni marcatori di selezione
 Siti di clonaggio

Centromero

 Sequenze
telomeriche
COSTRUZIONE BIBLIOTECHE di cDNA
PROCEDURA:
AAA
AAAA
Isolamento RNA messaggero
Sintesi DNA complementare
AAA
AAAA
AAA
AAAA
AAA
AAA
Trascrittasi
inversa
Clonaggio in un vettore
Questo tipo di biblioteche sono particolarmente utili per l’espressione
dei geni tessuto-specifici.
SINTESI cDNA
mRNA
7-mG
AAAAA-3’
Oligo (dT)
TTTTT
7-mG
AAAAA-3’
TTTT-5’
Trascrittasi inversa
dATP, dCTP, dTTP, dGTP
7-mG
AAAAA-3’
TTTT-5’
OH-3’
OH
7-mG
Frammento di Klenow
dATP, dCTP, dTTP, dGTP
7-mG
AAAAA-3’
TTTT-5’
AAAAA-3’
TTTT-5’
OH-3’
7-mG
AAAAA-3’
TTTT-5’
Rnasi H
Nucleasi S1
TTTT-5’
cDNA completo
TTTT-5’
cDNA incompleto
SCREENING mediante IBRIDIZZAZIONE SU PLACCA
Placche di lisi
•
•
•
Replica su filtri di nitrocellulosa
(conservare le piastre originali)
•
•
Denaturazione,
neutralizzazione elegame
del DNA al filtro
Punti di riferimento per l’orientazione
della replica al termine dell’esperimento
Recupero delle placche positive
dalla piastra originale
Autoradiogramma
che mostra la
posizione delle
sonde ibridizzate
•
•
•
•
•
•
Sonda ibridizzata
•
32P
•
Autoradiografia
•
•
Ibridizzazione con sonda marcata
e lavaggio della sonda non legata
32P
32P
32P
32P
32P
Sonda non legata
SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
Una sonda è un filamento di DNA complementare a quello che si vuole isolare dalla
biblioteca.
STRATEGIE DI SINTESI:
CASO 1:
E’ nota la sequenza amminoacidica
della proteina codificata dal gene
CASO 2:
E’ nota la sequenza nucleotidica
del gene di interesse
Si predice la sequenza nucleotidica che
dovrebbe codificare per quella proteina
Si sintetizzano chimicamente le sequenze nucleotidiche
(degenerate) più appropriate
o
si amplifica un frammento del gene di interesse mediante PCR
Nello screening di una libreria genica il cDNA può essere utilizzato come
sonda per l’isolamento del corrispondente gene.
MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
RANDOM PRIMING
Metodo dell’innesco casuale
5’3’-
NICK TRANSLATION
Spostamento dell’incisione
-3’
DNA
-5’
denaturazione
3’-TAGCAG-5’
aggiunta di inneschi
esanucleotidici
3’-GCATGC-5’
5’-TGCAGT-3’
-3’
5’3’-TAGCAG-5’
-5’
Frammento di Klenow,
dNTP
3’-TAGCAG-5’

5’-GCATAC-3’  

3’-
DNA sonda
marcato
5’3’-
GCAAG
CGCGTTC
GC
denaturazione

5’3’-

-5’
-3’
-5’
riempimento del buco prodotto con un
nucleotide radioattivo e rimozione del
nucleotide successivo
CAAG
CGCGTTC
GC G
-3’
-5’
il taglio si muove in
direzione 5’-3’
AAG
CGCGTTC
-3’
-5’
32P-dCTP
-5’




G
-3’
DNA
-5’
taglio di un’elica e rimozione
di un nucleotide mediante la
DNA polimerasi I
dGTP
-3’
5’-TGCAGT-3’ 
5’3’-
Sintesi DNA
5’3’-TAGCAG-5’
CGCGTTC
32P-dCTP
5’-GCATAC-3’
dATP
32P-dCTP
dTTP
dGTP
3’-
5’3’-
3’-TAGCAG-5’
3’-
GCGCAAG

ibridizzazazione
5’-GCATAC-3’
5’-TGCAGT-3’
5’3’-
GC G C
AG
CGCGTTC
-3’
-5’