frazionamento del campione - Tecniche di Laboratorio Biomedico

RUOLO E FINALITA’ DELLE
ANALISI DI LABORATORIO
Le analisi di laboratorio permettono di ricavare da test in vitro su
campioni biologici umani ( sangue,urine,fluidi biologici, cellule,
ecc),attraverso parametri chimico-fisici, delle informazioni sui
processi fisiologici e patologici che avvengono nell’organismo del
paziente a diversi livelli di organizzazione strutturale e cioè in
organi,tessuti, cellule o anche singole molecole ( DNA e proteine).
Attraverso i dati forniti dalle analisi di laboratorio il medico è
facilitato a formulare una diagnosi.
Le indagini che vengono richieste ai laboratori di analisi possono
essere di vari tipi:
•
Indagini tendenti ad esplorare il funzionamento di organi o vie metaboliche.
•
Indagini più mirate per valutare alcune funzioni specifiche di natura
biochimica
•
Test di urgenza od emergenza
•
Test singoli mirati, per seguire il decorso di una malattia o per effettuare il
monitoraggio di una terapia.
Le indagini diagnostiche si basano su determinazioni qualitative, ma soprattutto
quantitative.
I campioni biologici sono costituiti da piccole quantità di materiale
biologico ( liquidi biologici o tessuti).
I liquidi biologici sono ovviamente più accessibili per costituire un campione
biologico e quindi essi sono i mezzi più utilizzati nelle analisi di laboratorio.
I liquidi biologici più usati sono:
 il sangue: plasma, siero, eritrociti, leucociti, piastrine.
 le urine
 il liquido cerebrospinale
 il liquido sinoviale
 il liquido amniotico
 il latte
 il sudore
 le lacrime
I liquidi biologici più usati sono:
sangue: plasma, siero, eritrociti, leucociti, piastrine
 urine
liquido cerebrospinale
liquido sinoviale
liquido amniotico
latte
sudore
lacrime
saliva
succo gastrico
E’ possibile comunque utilizzare in alcuni casi anche campioni di tessuti(biopsie)
prelevati dall’organismo per effettuare indagini qualitative ma anche quantitative
di componenti chimici o biochimici che non possono trovarsi nei fluidi biologici o
perché sono macromolecole che non sono in grado di fuoriuscire dalle cellule di
cui sono composti i tessuti, sia perché si tratta di sostanze facilmente degradabili
e alterabili quando sono al di fuori della cellula.
I campioni biologici, perché non si alterino, devono essere conservati a 0-4°C e
prima di qualsiasi analisi l’analizzatore ( tecnico di laboratorio ) ne deve verificare
l’adeguatezza sia come volume del campione, sia per l’eventuale presenza di
composti che possono interferire nelle analisi ( es: siero lattescente dovuto alla
presenza di trigliceridi in alte concentrazioni,potrebbe essere stato effettuato il
prelievo su paziente non a digiuno ).
Queste interferenze devono essere valutate in base alle analisi da effettuare ed
eventualmente il campione deve essere rifiutato se si pensa che i risultati
possano essere alterati dalle interferenze.
LE TRE FASI:
• PREANALITICA
• ANALITICA
• POSTANALITICA
PRE-ANALITICA
Da dove parte la fase preanalitica?
Da una richiesta.
Chi formula questa richiesta?
Il medico di base,il clinico,il medico di
reparto,colui che ha bisogno di informazioni
(dati o risposte)che lo aiutino a fare
diagnosi, a fornire una terapia o modificarla.
Anche il privato cittadino per effettuare un controllo
(es: un test di gravidanza).
Il medico per fare diagnosi, oltre al consulto medico visivo e
tattile, ha la necessità di conoscere determinati parametri
fisiologici, che possono essere :
NORMALI
PATOLOGICI
POSITIVI
NEGATIVI
ASSENTI
PRESENTI
Questi dati forniti dal laboratorio lo potranno indirizzare verso
una patologia piuttosto che un’altra,confermare un sospetto.
Da qui l’importanza che riveste il ruolo del Laboratorio e di
conseguenza l’affidabilità e la competenza del Tecnico di
Laboratorio.
I dati da noi forniti possono essere determinanti, oppure indicativi
per la richiesta di ulteriori indagini più approfondite e specifiche.
PRE-ANALITICA:
• RICHIESTA
(dati anagrafici,sospetto di diagnosi o diagnosi).
• PRELIEVO DEL CAMPIONE
• ACCETTAZIONE DELLA RICHIESTA (conforme e non conforme)
• STAMPA ETICHETTA CON BARCODE (sono presenti tutti i dati
identificativi del paziente)
• ACCETTAZIONE DEL CAMPIONE
( conforme e non conforme)
• ETICHETTATURA
• SMISTAMENTO CAMPIONI
• CENTRIFUGAZIONE
( dove necessaria)
• SUDDIVISIONE CAMPIONE : ALIQUOTE DALLA PROVETTA
MADRE.
ANALITICA
E’ la fase in cui si analizzano i campioni dopo averli
esaminati ed avere segnalato le eventuali non conformità,
su apposite schede che verranno poi visionate da un
laureato medico, forniscono informazioni che possono
giustificare valori patologici( es: un K alto è giustificabile in
caso di emolisi).
Il campione può essere: coagulato, emolizzato, diluito, lipemico, itterico,
lattescente, scarso.
Nella fase analitica prima di eseguire qualsiasi esame su
uno strumento, il Tecnico di Laboratorio deve preparare
lo strumento, effettuando controlli, calibrazioni,controllando lo stato dei
reagenti e degli scarichi, solo dopo queste operazioni si potranno
caricare i campioni .
• Lo strumento stampa dei dati che noi
dovremo controllare ed eventualmente
ripetere per conferma e poi segnalare al
laureato in caso sia patologici.
• Una volta ottenuti i dati, questi vengono
validati ed inviati alla segreteria del
laboratorio.
POST-ANALITICA
• La segreteria riceve per via telematica i dati validati:
• li invia per via telematica o cartaceo ai reparti richiedenti
• li stampa e li imbusta se sarà un privato a ritirarli.
Nei referti alla voce : note
verranno segnalate le eventuali non conformità ( es: camp.
non suff.,non idoneo, provetta sbagliata,e così via).
Il referto potrà essere completo o parziale.
La provetta “madre “ verrà conservata in frigo, sierata e congelata,per
alcuni giorni prima di essere buttata nei rifiuti speciali.
Le provette si conservano per potere eventualmente eseguire altri
analiti o ripetere alcuni esami senza dovere ripungere il paziente.
TECNOLOGIE ANALITICHE
DI
USO CORRENTE
Le tecniche di laboratorio più utilizzate sono tecniche strumentali
nelle quali l’analita genera un segnale che viene rilevato e misurato
da uno strumento.
Le tappe previste sono:
– Frazionamento del campione con separazione ( purificazione)
dell’analita.
– Riconoscimento dell’analita nella miscela che lo contiene(es:
creatininuria nelle urine)
– Reazione con un reattivo specifico per formare il composto che
genera un segnale strumentale.
– Misura del segnale strumentale.
– Trasformazione dell’intensità del segnale strumentale in
concentrazione dell’analita, tramite curve di calibrazione.
FRAZIONAMENTO DEL CAMPIONE:
– PER VIA FISICA CENTRIFUGAZIONE O ULTRACENTRIFUGAZIONE.
– PER VIA CHIMICA PRECIPITAZIONE O ESTRAZIONE
– PER MIGRAZIONE ( ES: ELETTROFORESI)
RICONOSCIMENTO DEL CAMPIONE:
–
–
–
–
REAZIONE CHIMICA(ANALITA+ REATTIVO).
REAZIONE ENZIMATICA ( ENZIMA + SUBSTRATO).
REAZIONE IMMUNOCHIMICA(ANTIGENE + ANTICORPO).
METODI FISICI(ES: SEPARAZIONE).
TECNICHE STRUMENTALI E MISURA DEI SEGNALI:
– TECNICHE SPETTROFOTOMETRICHE( assorbimento molecolare:le
molecole assorbono energia luminosa ad una certa lunghezza d’onda
nel visibile: colorimetria o nell’ultravioletto) .
– TECNICHE RADIOISOTOPICHE(isotopi radioattivi,impiegati quasi
esclusivamente come marcatori di reazioni antigene-anticorpo,il più
usato è lo iodio centoventicinque).
Tecniche ottiche:
turbidimetria, nefelometria, emissione a fiamma
Tecniche elettrochimiche:
potenziometria, elettrodi iono-specifici
Tecniche biotecnologiche:
anticorpi monoclonali, biosensori, DNA ricombinante.
Spettrometria di massa.
Cromatografia liquida
Gascromatografia
Citometria a flusso.
CURVE di CALIBRAZIONE
In qualunque tecnica di analisi strumentale è necessario trasformare il
segnale misurato dallo strumento in un valore di concentrazione
dell’analita in oggetto, ciò si ottiene tramite i procedimenti di calibrazione.
Per effettuare una calibrazione, cioè per costruire una curva di
calibrazione, è necessario disporre di alcune soluzione dell’analita
in esame a varie concentrazioni i cui valori sono noti in modo molto
preciso.
Ciascuna di queste soluzioni è sottoposta al procedimento
analitico-strumentale in modo identico a quanto fatto per i campioni
incogniti.
Vengono così rilevati i valori dei segnali generati dalle soluzioni note e riportati
in grafico in funzione della concentrazione delle soluzioni dell’analita,
costruendo così una curva (o retta) detta :
CURVA di CALIBRAZIONE.
Tali curve di calibrazione sono poi utilizzate per convertire i valori
del segnale strumentale misurato su campioni incogniti nei
corrispondenti valori di concentrazione dell’analita.
In alcuni casi la funzione: segnale/concentrazione, è lineare in altri
casi no, la conversione è più difficile e si utilizzano funzioni
matematiche analizzate dal computer.
In alcuni casi è possibile una soluzione a concentrazione nota
pesando l’analita e sciogliendolo in un solvente acqua, soluzione
tampone siero ecc.
Quando l’analita non è puro si utilizzano metodiche di calibrazione
più complicate.