Elettroforesi

ELETTROFORESI
Metodo di separazione basato sulla diversa velocità di
migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un
campo elettrico
MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI
IONIZZABILI
Aminoacidi
proteine
Acidi nucleici
nucleotidi
ELETTROFORESI
Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.
Tecnica soprattutto ANALITICA ma anche PREPARATIVA.
E’ un mezzo di separazione molto potente, fra i piu’ usati in
biochimica


Metodi FRONTALI - in soluzione libera
Metodi ZONALI – attraverso un mezzo poroso



Gel (agarosio – amido)
Carta
Acetato di Cellulosa
FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA’
DI MIGRAZIONE

Natura del supporto

Campo elettrico applicato

Caratteristiche della particella:




Massa
Carica
Dimensioni
forma
m=
m mobilità elettroforetica
velocità di migrazione
Campo elettrico applicato
NATURA DEL SUPPORTO

assorbimento – ritenzione di molecole da parte del
supporto

Elettroendosmosi – per la presenza di gruppi

carichi sulla superficie del mezzo di supporto
Carta – COOH
Agarosio – SO4pareti di vetro – Si-OH

Filtrazione molecolare – effetto setaccio


CAMPO ELETTRICO APPLICATO
Voltaggio – Corrente - Resistenza

La differenza di potenziale tra gli elettrodi
genera:
E
E = gradiente di potenziale
 V = voltaggio applicato
 d = distanza fra gli elettrodi
Intensità di corrente = Voltaggio applicato /
Resistenza


=V/d
INFLUENZA DEL TAMPONE

ha la funzione di mantenere le molecole del
campione in uno stato di ionizzazione
COMPOSIZIONE: non deve legarsi ai composti da separare

CONCENTRAZIONE: da 0.05 a 0.10 M

pH : determina, influenza, stabilizza la velocità di
migrazione

RISULTATI RIPRODUCIBILI
VOLTAGGIO O AMPERAGGIO COSTANTI


CARATTERISTICHE DELLA MOLECOLE
SOTTOPOSTE A ELETTROFORESI
Carica – dimensioni - massa

A parità di condizioni elettroforetiche:



Campo Elettrico applicato
Supporto in cui avviene l’elettroforesi
Le molecole si separano sulla base del rapporto
Carica/Massa
Un sistema per elettroforesi è costituito da


Alimentatore
Camera (Cella) elettroforetica



Supporto



Orizzontale
Verticale
Gel (agarosio o poliacrilamide)
Solido poroso (carta da filtro o acetato di cellulosa)
Sulla base alla composizione del mezzo in cui
avviene l’elettroforesi :




Elettroforesi in condizioni native – denaturanti – riducenti
Isoelettrofocalizzazione (IEF)
Elettroforesi bidimensionale
Elettroforesi su gradiente
ELETTROFORESI SU SUPPORTO
su carta
su gel
CELLA ELETTROFORETICA CON GEL VERTICALE
GEL DI AGAROSIO:
usato per separare frammenti di DNA grandi (da
500 bp a 20-40* Kbp)

GEL DI ACRILAMMIDE:
usato per separare frammenti di DNA piccoli (da
1 nucleotide a ca 2 Kbp)

I FRAMMENTI DI DNA SI MUOVONO VERSO IL POLO
POSITIVO AD UNA VELOCITA’ INVERSAMENTE
PROPORZIONALE AL LOGARITMO DELLA LORO
LUNGHEZZA
(rapporto CARICA / MASSA è COSTANTE)
Nei gel di agarosio i pori sono formati da molecole di
polisaccaridi che partecipano alla formazione di strutture a
doppia elica
Questi “pori” non hanno una struttura regolare e la loro
dimensione si controlla variando la concentrazione di
agarosio
Piu’ agarosio si usa più grande sarà il numero delle eliche
formate per unita’ di spazio e piu’ piccola sara’ la dimensione
media dei pori
GEL DI AGAROSIO
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO







Separazione ed analisi di campioni contenenti DNA o
RNA
Si scioglie l’agarosio in polvere nel tampone in seguito
ad EBOLLIZIONE della sospensione
Dopo raffreddamento fino alla temperatura di ca 5560°C la soluzione si versa in un vassosio dove
gelificherà
Un pettine genera gli spazi dove in seguito si
depositano i campioni
Il gel viene immerso completamente nel tampone
Migrazione verso il polo positivo (anodo)
separazione in base alla MASSA dei frammenti di
DNA/RNA poiché qualunque DNA/RNA si consideri il
rapporto CARICA / UNITA’ DI MASSA è costante
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
GEL DI AGAROSIO
(C)
(A)
(B)
A) GEL POSTO SUL TRANSILLUMINATORE AD UV SPENTO
B) GEL POSTO SU TRANSILLUMONATORE AD UV ACCESO
C) IMMAGINE DIGITALIZZATA A TONI DI GRIGIO DEL GEL IN B)
Fattori che influenzano la migrazione
del DNA in gel di agarosio
• Peso molecolare (peso dei DNAdi DNA
in Daltons)
• Concentrazione di agarosio
• Conformazione DNA (lineare, circolare
(superavvolto o rilassato)
• Voltaggio applicato
• Intercalanti
• Tampone di elettroforesi
Tamponi di elettroforesi
Soluzioni di caricamento
Soluzioni per il caricamento di DNA su gel
• Aumentano la densità del campione
• Colorano il campione
• Rendono visibile la corsa elettroforetica
La velocita’ di migrazione (o mobilità
elettroforetica) dipende:





1) dalle dimensioni dei frammenti
2) dalla percentuale dell’agarosio nel gel
3) dal voltaggio applicato.
Frammenti lineari piccoli migrano più velocemente rispetto a
quelli grandi
A parità di peso molecolare, il DNA circolare migra più
velocemente di un DNA lineare se assume una
conformazione detta superavvolta (super coiled DNA), più
lentamente se la molecola circolare contiene uno o più
rotture sui filamenti di DNA (forma rilassata o open-circular)
DNA circolare con
superavvolgimento = 0
DNA superavvolto
negativamente
Migrazione del DNA nel gel
•
•
•
Esiste una relazione inversa tra la mobilità
elettroforetica (Distanza migrata rispetto al
pozzetto, in cm) e la lunghezza del frammento di
DNA (in daltons; log10 della lunghezza)
Questa relazione è lineare per buona parte della
distanza migrata (vedi curve) anche variando la
concentrazione di agarosio (%ali indicate)
Ciò consente di creare delle “rette di regressione”
facendo migrare nel gel DNA a lunghezza nota e
confrontando la migrazione dei marcatori con la
migrazione di DNA di lunghezza ignota, del quale si
può in questo modo stimare la lunghezza in paia di
basi
N.B.: sarebbe più corretto parlare di log10 del PESO
MOLECOLARE di un DNA ma il peso molecolare di
fatto equivale alla sua lunghezza. Es.: un DNA
lineare lungo 1000 paia di basi ha un peso
molecolare di 1000 x 660 = 660000 (660 è il peso
medio di una coppia di basi. Il calcolo si fa
ipotizzando DNA a composizione media di A, T, C,
G in proporzioni uguali)
Come si rivelano nel gel gli acidi nucleici?




Colorazione con ETIDIO BROMURO (EtBr, colorante
fluorescente) o con coloranti alternativi che hanno la
stessa funzione ma non sono mutageni/tossici
Il EtBr contiene un gruppo planare che si intercala tra
le coppie di basi del DNA.
il colorante viene quindi visualizzato irradiando il gel
con raggi U.V. (ad esempio con un transilluminatore);
in questo modo si visualizzano i frammenti di DNA a
cui il ETBr si è associato
Una volta i gel si fotografavano su pellicola, Polaroid o
simile. Oggi si utilizzano apparecchi dotati di sensori
CMOS o CCD (una tecnologia molto simile a quella
delle macchine fotografiche digitali)
Come si rivelano nel gel gli acidi nucleici?




I gel di agarosio correntemente vengono fotografati
digitalizzando le immagini sia per l’analisi dei risultati
che per ulteriori utilizzi.
la sensibilità del rilevamento consente di visualizzare
singole bande di DNA contenenti un minimo di 20-50*
nanogrammi.
Come detto prima esistono in commercio molti coloranti
non pericolosi e privi di rischi che si possono utilizzare
in alternativa al EtBr
Nonostante le assicurazioni delle ditte questi coloranti
spesso non hanno la stessa sensibilità di rilevamento
del EtBr. QUINDI: se fate elettroforesi di DNA con
coloranti alternativi al EtBr, usate più DNA: almeno 100
nanogrammi per singola banda di DNA da visualizzare
Visualizzazione del DNA
Snustad, Simmons – Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15
Il Bromuro di Etidio assorbe gli UV con un picco a 285 nm e
restituisce fluorescenza nell’arancio con un picco a 605 nm
(solo se è intercalato al DNA)
Marcatori di peso molecolare
 HindIII
I numeri
indicano la
lunghezza dei
frammenti in
paia di basi
Fotodocumentazione
IMAG0887.jpg
Snustad, Simmons – Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15
Mappe di restrizione del
DNA
Tagliando un DNA con uno o più
enzimi di restrizione e facendo poi
migrare su gel i prodotti delle
digestioni si ottengono “profili
elettroforetici” che consentono di
stabilire la posizione dei siti di
taglio degli enzimi usati sul DNA,
cioè consentono di disegnare una
mappa del DNA sulla quale
posizionare i siti di taglio in modo
ordinato
La procedura è visualizzata nelle
diapositive seguenti con una
piccola animazione
1
2 Simmons
3
Snustad,
–4Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15
1
10 kb
1
2 Simmons
3
Snustad,
–4Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15
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2
Eco R1
3 kb
7 kb
1
2 Simmons
3
Snustad,
–4Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15
1
10 kb
2
Eco R1
7 kb
3 kb
3
PstI
4 kb
6 kb
6 kb
PstI
4 kb
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2 Simmons
3
Snustad,
–4Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15
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Eco R1
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3
PstI
6 kb
PstI
4 kb
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6 kb
4
Eco R1 PstI
3 kb
1 kb
6 kb
PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis Elettroforesi a Campi Pulsati
E’ un particolare tipo di elettroforesi in gel di agarosio:
il campo elettrico è a IMPULSI DI CORRENTE ed è
orientato, spesso a 120°, tra un impulso e il seguente
Consente di separare DNA MOLTO grandi, anche interi
cromosomi
Nella figura sono visualizzati i cromosomi di un isolato
di Plasmodium falciparum (clone 3D7) e della linea di
riferimento Palo Alto. I marcatori di peso molecolare
sono ricavati dalla migrazione di un ceppo di lievito
(Hansenula wingei, BioRad). In ogni corsia sono stati
applicati circa 2 x 107 parassiti. Il DNA è stato separato
su un apparato CHEF (BioRad) usando un gel allo 0.8%
di agarosio in 0.5x TBE a 18°C. Impulsi da 90 sec a 300
sec per 24 hr a 95 volts seguiti da impulsi da 300 sec a
720 sec per 24 hr a 85 volts.
I profili PFGE possono servire a stabilire relazioni tra batteri che
esibiscono pattern simili di resistenza multipla ad antibiotici e
quindi a meglio inquadare le patologie dovute ai batteri. Nella
figura profili PFGE di S.aureus multiresistenti alla meticillina
ottenuti con l’enzima SmaI. I ceppi B e C sono identici.
Profili PFGE di digestioni SmaI di S.
pneumoniae. A, marcatori di peso
molecolare; B e C ceppi penicillina
sensibile e resistente, rispettivamente,
isolati dallo stesso paziente.
In sostanza, la tipizzazione molecolare con PFGE di isolati batterici rappresenta
uno strumento utile ed efficace per contribuire in campo epidemiologico e clinico
alla diagnosi, terapia e controllo delle infezioni da microrganismi