Lezione 12 2010-11

Alessia Stell
Adriana Maggi Lab
2 Dicembre 2010
Ingegneria animale e animali
transgenici
Manipolazione genetica tradizionale
Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE
Cosa mancava per passare dalla
manipolazione genetica tradizionale a
quella moderna?
1967:
Scoperta della DNA ligasi
1968:
Scoperta degli enzimi di
restrizione
1972:
Avanzamenti nelle tecniche
di trasferimento del DNA e
nell’uso di plasmidi
Animale Transgenico:
animale nel cui genoma è stato inserito
uno o più frammenti di DNA esogeno
Transgene:
frammento di DNA esogeno integrato
stabilmente nel patrimonio genetico di
cellule animali o vegetali
Metodi di
Ingegneria animale
Sono 3 i metodi principali di ingegneria
animale
Transgenesi standard
Gene Targeting
Clonazione
Transgenesi standard
Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata
• SCOPO: Guadagno di funzione
• CARATTERISTICA: inserzione random, casuale
Introduzione di una sequenza
di DNA purificata in uno dei
due pronuclei della cellula uovo
fecondata
La procedura per ottenere la transgenesi
standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
degli oociti
fecondati
2. Preparazione
dei costrutti
3. Preparazione
delle femmine
“pseudogravide”
4. Screening
della progenie
La procedura per ottenere la transgenesi
standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
degli oociti
fecondati
2. Preparazione
dei costrutti
Cocktail ormonale per la
superovulazione:
• PMS (pregnant mares serum)
• HCG (human chorionic
gonadotropin)
♀
3. Preparazione
delle femmine
“pseudogravide”
Accoppiamento
4. Screening
della progenie
Raccolta degli oociti
fecondati
♀
♀
♂
La procedura per ottenere la transgenesi
standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
degli oociti
fecondati
2. Preparazione
dei costrutti
Costruzione del transgene
3. Preparazione
delle femmine
“pseudogravide”
Amplificazione del
transgene
4. Screening
della progenie
Purificazione del
transgene
La procedura per ottenere la transgenesi
standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
degli oociti
fecondati
2. Preparazione
dei costrutti
Accoppiamento delle femmine
con maschio vasectomizzato
3. Preparazione
delle femmine
“pseudogravide”
4. Screening
della progenie
Trasferimento delle uova fecondate
microiniettate con il gene di interesse
nell’utero di femmina pseudogravida
♀
100-200X
♂ vasectomizzato
♀ pseudogravida
La procedura per ottenere la transgenesi
standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
degli oociti
fecondati
2. Preparazione
dei costrutti
3. Preparazione
delle femmine
“pseudogravide”
4. Screening
della progenie
Estrazione DNA dalle code
della progenie
Analisi tramite PCR
M
C
1
2
3
Analisi tramite Southern-blot
4
5
C
1
2
3
4
5
L’inserzione del transgene è casuale
• RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA
• Non si sa dove si è localizzato il transgene;
• Non si può regolare il numero di copie introdotte nel
pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per
l’integrazione;
• Guadagno di funzione o perdita di funzione?
“Incrociamo le
dita!!”
Gene Targeting
Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
• SCOPO: Perdita o modifica di funzione
• CARATTERISTICA: inserzione mirata
La RICOMBINAZIONE OMOLOGA è il meccanismo
che permette il gene targeting
AGGTGCCTGACT
X
AGGTGCCTGACT
TTCAGCCGATCCA
Gene inattivo
X
TTCAGCCGATCCA
La procedura per ottenere il gene targeting si
basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
delle ES cells
pluripotenti e
trasfezione
2. Selezione
delle ES
3. Iniezione
delle ES
trasfettate in
una nuova
blastocisti
4. Screening
della
progenie
La procedura per ottenere il gene targeting si
basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
delle ES cells
pluripotenti e
trasfezione
2. Selezione
delle ES
Preparazione delle ES
pluripotenti dalla blastocisti
3. Iniezione
delle ES
trasfettate in
una nuova
blastocisti
4. Screening
della
progenie
Preparazione del transgene
Gene non attivo
Tk - thymidine
kinase
Sequenze di
ricombinazione
Omologa
Neor – resistenza
alla Neomicina
Elettroporazione
La procedura per ottenere il gene targeting si
basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
delle ES cells
pluripotenti e
trasfezione
2. Selezione
delle ES
3. Iniezione
delle ES
trasfettate in
una nuova
blastocisti
4. Screening
della
progenie
Trattamento con neomicina e
ganciclovir
No integrazione
Gene non attivo
Tk - thymidine
kinase
Sequenze di
ricombinazione
Omologa
Neor – resistenza
alla Neomicina
X
Integrazione sito-specifica (1/1000)
Integrazione random
X
La procedura per ottenere il gene targeting si
basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
delle ES cells
pluripotenti e
trasfezione
2. Selezione
delle ES
3. Iniezione
delle ES
trasfettate in
una nuova
blastocisti
4. Screening
della
progenie
ES inserite in una
blastocisti di topo nero
La procedura per ottenere il gene targeting si
basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione
delle ES cells
pluripotenti e
trasfezione
2. Selezione
delle ES
Topo “chimera”
3. Iniezione
delle ES
trasfettate in
una nuova
blastocisti
4. Screening
della
progenie
L’inserzione del transgene è mirata
• RICOMBINAZIONE OMOLOGA
• Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del
transgene;
• Problemi: espressione tempo e spazio specifica?
“Obiettivo
raggiunto!”
Clonazione
Trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un oocita
anucleato
• SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse
I Cloni vengono ottenuti attraverso
Somatic Cell Nuclear Transfer
Il materiale genetico viene copiato in toto
• Nuclear Transfer
• Le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo possono essere
ingegnerizzate prima del reimpianto.
Altre tipologie di
Ingegneria animale
Altre tecniche, oltre a quelle classiche, sono
state sviluppate in ingegneria animale
Knockout condizionali
Animali reporter
Knockout condizionali
Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase
particolare di sviluppo
• SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del
gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout.
Il sistema Cre-LoxP è uno dei sistemi più
utilizzati
La CRE è una RICOMBINASI
LOXP sono le sequenze
riconosciute da CRE
Gene da excidere
Esempio: delezione di IGF-1 fegato-specifica:
topi LID (liver IGF1 specific deficient)
Esone 4
Cre
X
Promotore dell’albumina
LoxP
X
CRE
80% IGF-I plasmatico
Animali reporter
Inserimento di un gene codificante una proteina facilmente
identificabile e rilevabile
• SCOPO: la proteina reporter dà informazioni rapide e
dinamiche sugli eventi molecolari che si vogliono studiare
La luciferasi è uno dei geni reporter più
utilizzati nei topi
Sequenze
regolatorie
• Gene ESOGENO
• Emivita breve
• Facilmente detectabile
Esempio: il topo reporter ERE-Luc
MAR
ERE X2
Tk
Luciferasi
Transgene inserito nel topo ERE-Luc
MAR
Applicazioni pratiche dell’
Ingegneria animale
Transgenesi
standard
Gene
targeting
Studio di
funzione genica
(ricerca di base)

Modelli di
patologia umana

Produzione di
biofarmaci

Clonaggio
KO
condizionale
Animale
reporter






Screening di
farmaci
Produzione di
organi per
xenotrapianti


Studio di funzione genica (ricerca di
base)
Inserimento di gene (o boost
dell’espressione di un gene)
tramite transgenesi standard
Palmiter et al, Nature, 1982
Delezione di un gene tramite
gene targeting
Modelli di patologia umana
Inserimento di gene (o boost
dell’espressione di un gene) tramite
transgenesi standard:
Delezione di un gene tramite gene
targeting:
• Apolipoproteina E: aterosclerosi
• Oncogeni (c-neu, c-myc, H-ras):
tumori
• Glucocerebrosidasi: malattia di
Gaucher
• Antigeni di istocompatibilità:
autoimmunità
• CFTR umana: fibrosi cistica
• β-globina umana: talassemia
• […]
• Recettore LDL: aterosclerosi
• APP umana: morbo di Alzheimer
Esempio: modelli di overespressione di APP
umana per lo studio della malattia di
Alzheimer
Lord A, Neurobiol Aging, 2006
+ Emoglobina
+ tPA
+ GH
+ Insulina
Produzione di biofarmaci
Produzione di proteine ricombinanti
biologicamente attive nella ghiandola
mammaria di animali transgenici
Pro/contro del “biopharming”
• Abbondanza: 5–10g/L al giorno
paragonato ad 1 g/L delle cellule.
• Tempistiche: lunghi tempi per
messa a punto e valudazione di
animali transgenici
• Costo
• Attesa della lattazione
• Adattabilità alle richieste
• Funzionalità: le proteine sono
folded in maniera naturale
• Raccolta: facile purificazione dal
latte
• Inserzione casuale: può causare
problemi all’animale
Screening di farmaci
Promotore
attivato
REPORTER
• L’attività del promotore è osservata
in tempo reale e nel contesto
fisiologico dell’intero organismo
Che caratteristiche deve avere un animale
reporter per permettere lo screening di
farmaci?
• Permettere di localizzare le aree
dove il composto è attivo
• Permettere di valutare la risposta
del farmaco dopo ripetute
somministrazioni
• Permettere la misurazione della
minima dose efficace
• Permettere di identificare siti di
accumulo in caso di somministrazioni
croniche
Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci
– in acuto
Nelle aree del corpo dell’animale
Nelle aree del cervello dell’animale
Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci
– in cronico
Produzione di organi per
xenotrapianti
Inserimento in animali transgenici
della fucosio-transferasi
Rigetto dovuto alla reattività degli
anticorpi umani verso le proteine
endoteliali esogene (che mancano di
uno zucchero, il fucosio)