Elettroforesi in condizioni native – denaturanti

MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI
IONIZZABILI
Aminoacidi
proteine
Acidi nucleici
nucleotidi
ELETTROFORESI
Metodo di separazione basato sulla diversa velocità di
Migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un
Campo elettrico
ELETTROFORESI
Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.
Tecnica soprattutto ANALITICA ma anche PREPARATIVA.
E’ un mezzo di separazione molto potente, fra i piu’ usati in
biochimica


Metodi FRONTALI - in soluzione libera
Metodi ZONALI – attraverso un mezzo
poroso
carta
gel
Acetato di cellulosa
UN METODO ANALITICO

NUMERO di proteine presenti in una miscela

GRADO DI PUREZZA

PUNTO ISOELETTRICO

PESO MOLECOLARE
FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA’ DI
MIGRAZIONE

Natura del supporto

Campo elettrico applicato

Caratteristiche della particella:




Massa
Carica
Dimensioni
forma
m mobilità elettroforetica
m = velocità di migrazione
Campo elettrico applicato
V
E
NATURA DEL SUPPORTO

assorbimento – ritenzione di molecole da parte del
supporto (coda)

Elettroendosmosi – per la presenza di gruppi

carichi sulla superficie del mezzo di supporto
Carta – COOH
Agarosio – SO4pareti di vetro – Si-OH

Filtrazione molecolare – effetto setaccio


CAMPO ELETTRICO APPLICATO
Voltaggio – Corrente - Resistenza

La differenza di potenziale tra gli elettrodi
genera:
E
E = gradiente di potenziale
 V = voltaggio applicato
 d = distanza fra gli elettrodi
Intensità di corrente = Voltaggio applicato /
Resistenza


=V/d
Aumentare della distanza fra
Gli elettrodi
+

RESISTENZA
_
Aumenta la forza ionica del tampone
Aumenta la temperatura
INFLUENZA DEL TAMPONE

ha la funzione di mantenere le molecole del
campione in uno stato di ionizzazione
COMPOSIZIONE: non deve legarsi ai composti da separare

CONCENTRAZIONE: da 0.05 a 0.10 M

pH : determina, influenza, stabilizza la velocità di
migrazione

RISULTATI RIPRODUCIBILI
VOLTAGGIO O AMPERAGGIO COSTANTI


CARATTERISTICHE DELLA PARTICELLA
Carica – dimensioni - massa

A PARITA’ DI CONDIZIONI ELETTROFORETICHE
CAMPO ELETTRICO

SUPPORTO
Le molecole si separano sulla base del
rapporto:
 CARICA / MASSA
Un apparato per elettroforesi è costituito da


ALIMENTATORE
CAMERA ELETTROFORETICA
Verticale
Orizzontale

SUPPORTO

SOLIDO POROSO
(su carta da filtro o acetato di cellulosa)

Sulla base alla composizione del mezzo in cui avviene
l’elettroforesi :

· Elettroforesi in condizioni native – denaturanti - riducenti
Isoelettrofocalizzazione (IEF)
· Elettroforesi bidimensionale
· Elettroforesi su gradiente



SU GEL
(poliacrilammide o Agarosio)
ELETTROFORESI SU SUPPORTO
su carta
su gel
GEL DI AGAROSIO:
usato per separare frammenti di DNA grandi
(da 500 bp a 20 Kb)

GEL DI ACRILAMMIDE:
usato per separare frammenti di DNA piccoli
(da 1 nucleotide a 2 Kb)


I FRAMMENTI DI DNA SI MUOVONO VERSO IL
POLO POSITIVO
AD UNA VELOCITA’ INVERSAMENTE
PROPORZIONALE AL LOGARITMO DELLA LORO
LUNGHEZZA
(rapporto CARICA / MASSA è COSTANTE)
ELETTROFORESI SU GEL DI
POLIACRILAMMIDE




Utilizzata per la separazione di PROTEINE e di
ACIDI NUCLEICI
Il gel si ottiene dalla polimerizzazzione di molecole
di ACRILAMMIDE e con la formazione di legami
crociati in presenza di METILEN-BISACRILAMMIDE
Il processo di polimerizzazione è innescato
dall’aggiunta di TEMED (tetrametilendiammina) e
persolfato
GEL DI ACRILAMMIDE: usato per separare
frammenti di DNA piccoli ( da 1 nucleotide a 2 Kb)
Formazione di un gel di poliacrilammide
Rivelazione, stima quantitativa e recupero da gel
elettro-eluizione
densitometria
a scansione
Comparison of the sensitivity achieved with SYPRO, silver and Coomassie
brilliant blue stains. Identical SDS-polyacrylamide gels were stained with A)
SYPRO Orange protein gel stain, B) SYPRO Red protein gel stain; C) silver
stain and D) Coomassie brilliant blue stain, according to standard protocols.
ELETTROFORESI IN CONDIZIONI
DENATURANTI (gel di poliacrilammide in
UREA)






Separazione di frammenti di DNA
UREA 7 M aggiunta al gel mantiene denaturati
(a singolo filamento) i frammenti di DNA
Gel lungo (fino a 50-60 cm) e sottile
Ad alto voltaggio (circa 2000V)
I frammenti migrano solo in base alla loro lunghezza
DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA
NUCLEOTIDICA
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO







Separazione ed analisi di campioni contenenti DNA o
RNA
Si scioglie l’agarosio in polvere nel tampone in seguito
ad EBOLLIZIONE della sospensione
Dopo raffreddamento fino alla temperatura di 45°C la
soluzione si versa in uno stampo dove gelificherà
Un pettine genera gli spazi per depositare i campioni
Il gel viene immerso completamente nel tampone
Migrazione orizzontale verso il polo positivo (anodo)
separazione in BASE ALLA LORO MASSA poiché il
loro rapporto CARICA / MASSA è costante
La velocita’ di migrazione dipende:




1) dalle dimensioni dei frammenti
2) dalla percentuale dell’agarosio nel gel
3) dal voltaggio applicato.
Frammenti lineari piu’ piccoli migrano piu’
velocemente rispetto a quelli piu’ grandi,
mentre, a parita’ di peso molecolare, il DNA
circolare migra piu’ velocemente di un DNA
lineare, in quanto assume una conformazione
detta super avvolta (super coiled DNA)
Come si rivelano gli acidi nucleici?





Colorazione con ETIDIO BROMURO (colorante
fluorescente)
Questo composto contiene un gruppo planare
che si intercala tra le coppie di basi del DNA.
il colorante viene quindi visualizzato irradiando
con raggi U.V. (ad esempio con un
transilluminatore) e fotografandolo su un film
polaroid.
la sensibilità del rilevamento è solitamente
migliore di 0.1 mg di DNA.
Dal momento che l'etidio è un agente
intercalante, è un potenziale mutageno.
SOUTHERN BLOT
IMPRONTA DEL DNA basata sui polimorfismi di sequenza cioè piccole
differenze di sequenza presenti in media ogni 500 – 1000 coppie di basi e
Diverse da individuo ad individuo ( polimorfismi della lunghezza dei
frammenti di restrizione o RFLP)
ELETTROFORESI DI PROTEINE
su gel di poliacrilammide
La porosità del gel dipende dal rapporto
ACRILAMIDE/BIS-ACRILAMIDE

LA VELOCITA’ DI MIGRAZIONE DIPENDE
Carica netta
 Dimensione
 Corrente applicata
 Dal valore di pH del tampone
A pH fisiologici la maggior parte delle proteine è sotto
forma di ANIONI (-)

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI NATIVE





Permette di individuare un enzima o proteina per
la sua ATTIVITA’ BIOLOGICA
Le proteine conservano la loro carica nativa
Separazione: rapporto CARICA / MASSA
nel gel è possibile incubare un substrato:
l’enzima si lega e sviluppa un prodotto colorato
PAGE al 7,5 % in sistema refrigerato per
evitare denaturazione
ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI
SDS-PAGE








Le proteine si denaturano con molecole di SDS ogni due
residui di Aminoacidi
La carica nativa della proteina viene eliminata dalle
molecole di SDS cariche negativamente
SI ALLESTISCE:
Running gel matrice al 10% di PAGE in cui avviene la
separazione
Staking gel al 4%
TUTTE LE PROTEINE SONO CARICHE
NEGATIVAMENTE (migrano verso l’anodo)
SEPARAZIONE BASATA SULLE DIMENSIONI
(gel come setaccio molecolare)
SDS-PAGE
(Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
•Fissaggio del gel in metanolo e acido
acetico
•Colorazione con Blu di Coomassie
•Valutazione della PUREZZA DEI
CAMPIONI
•DETERMINAZIONE DEL PESO
MOLECOLARE rispetto a
STANDARD DI RIFERIMENTO
La mobilità di una proteina è direttamente proporzionale al logaritmo decimale
della MASSA MOLECOLARE
IEF ISOELETTROFOCALIZZAZIONE







separazione di sostanze anfotere
Separazione sulla base del pi
GEL con GRADIENTE DI pH
Si usano GLI ANFOLITI (elettroliti anfoteri)
Sono miscele di acidi alifatici sintetici poliamminopolicarbossilici che formano un gradiente di pH nella
matrice prima della sua polimerizzazione
Gli analiti migrano verso la zona di pH corrispondente al
proprio punto isoelettrico (FOCALIZZAZIONE)
E’ utile una CALIBRAZIONE con proteine a pi noto
Il gradiente di pH e’ formato dall’ introduzione nel gel di composti
conosciuti come “anfoliti”, che sono miscele complesse di acidi
poliammino-policarbossilici sintetici.
Gli anfoliti possono essere acquistati per diversi range di pH, sia
a banda larga (ad es. da pH 3 a pH 10) che a banda stretta (ad es.
da pH 7 a pH 8)
USO: per separare forme isoenzimatiche e per determinare
il punto isoelettrico di una proteina
MAPPA DI PROTEINE: confronto tra normale e malato
SEQUENZIAMENTO di proteina da singola macchia
Analisi con SPETTROMETRIA DI MASSA
FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA
Un’altra tecnica, oltre alla cromatografia a scambio ionico, che permette la
separazione di macromolecole sulla base della loro carica. Estremamente potente
Catodo (-)
Anodo (+)
 Miscela di anfoliti
Focalizzazione isoelettrica di
alcune varianti della stessa
proteina, l’emoglobina :
Trasferimento su un foglio di
nitrocellulosa
Nel punto in cui è localizzata la proteina che interessa si forma una banda
Colorata- L’immunoblot consente di identificare proteine anche in quantità
Molto piccole e di definire il loro peso molecolare
Una applicazione clinica del Western Blot
Viral Proteins
HIV, like any other virus, is composed of a number of different
proteins. The Western Blot positive control lane contains
proteins from patient sera as well as HIV proteins. HIV positivity
can therefore only be confirmed by the presence of the
following types of proteins:
gp160 viral envelope precursor (env)
gp120 viral envelope protein (env) binds to CD4
p24 viral core protein (gag)
p31 Reverse Transcriptase (pol)
Band pattern interpretation
In 1987 the Centers for Disease Control along with several
other organizations established criteria for serologic
interpretation of HIV Western blot tests. The criteria are listed
below.
No bands present
 Negative
Bands at either p31 OR p24 AND
bands present at either gp160 OR gp120  Positive
Bands present, but pattern does not meet criteria for
positivity
 Indeterminate
Lane 1, HIV+ serum
(positive control)
Lane 2, HIV- serum
(negative control)
Lane A, Patient A
Lane B, Patient B
Lane C, Patient C
Capillary Electrophoresis (CE)
Advantages of Capillary
Electrophoresis
High separation efficiency
(105 to 106 theoretical
plates)
Small sample size required
(1-10 ul)
Fast separation (1 to 45 min)
Easy and predictable
selectivity
Automation
Quantitation (linear)
Reproducibility
Couple to mass spectrometer
Types of Molecules that can be separated by Capillary Electrophoresis
Proteins, Peptides, Amino acids Nucleic acids
Inorganic ions, Organic bases, Organic acids Whole cells
•Fissaggio del gel in metanolo
e acido acetico
•Colorazione con Blu di
Coomassie
•Valutazione della PUREZZA
DEI CAMPIONI
•DETERMINAZIONE DEL
PESO MOLECOLARE delle
proteine rispetto a
STANDARD DI RIFERIMENTO
•Nell’esempio la purificazione
dell’enzima RNA Polimerasi da
E.Coli
Elettroforesi di proteine in condizioni native
(A) Analysis of binding of the
b subunit cytoplasmic domain
(bsol) to ECF1 and ECF1 (-).
Mixtures of polypeptides were
first analyzed by native agarose
gel electrophoresis (A) through a
1% agarose gel.
Lanes from left to right:
I, ECF1 (-)
II, bsol ; III, 
IV, bsol +  ;
V, bsol + ( 1-134);
VI, bsol + ECF1 (-);
VII,  + ECF1 (-);
VIII, bsol +  + ECF1 (-);
IX, ECF1 (-) + ( 1-134);
X, bsol + ECF1 (-) + ( 1-134).
(B) Bands were excised from
the agarose gel and
separated on a 10-18%
gradient of polyacrylamide in
SDS.
Rodgers et al (1997) J. Biol. Chem. 272: 31058