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SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
• Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o
quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione.
• E’ possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato enzima in un
fluido biologico misurandone l’attività con substrati specifici.
• Possiamo determinare i parametri cinetici (KM , Kcat o attività specifica) di un
particolare enzima.
CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO
 Controllo del pH con una soluzione tampone
 Controllo della temperatura
 Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli)
SAGGI DI ATTIVITA’
{
CONTINUI
DISCONTINUI o A PUNTI FISSI
In un saggio di attività enzimatica noi misuriamo il prodotto della reazione, più di
rado misuriamo il consumo di substrato.
SAGGI CONTINUI
 Sono più accurati e meno laboriosi di quelli discontinui
 Per lo più usano metodi spettrofotometrici
• SAGGI DIRETTI
E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo
o fluorescente – fluoroforo)
Esempio:
O
C
O-
C
O
+ NADH
CH3
Piruvato
O
C
H C
Lattato
Deidrogenasi
(LDH)
OOH
CH3
Lattato
+ NAD+
• SAGGI ACCOPPIATI
E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente)
E2 + P  E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato)
COO-
Esempio:
+H N
3
H3C
C
H
L-treonina
COO-
aldolasi
+H N
3
CH2
C
O
+
H
H3C
C
H
H
OH
glicina
L-treonina
O
H3C
C
H
+
NADH
alcol
deidrogenasi
OH
H3C
acetaldeide
acetaldeide
CH2
+
NAD+
alcol etilico
ACCOPPIAMENTO CON REAZIONE IRREVERSIBILE
A
E1
E2
B  C
[Etot] = 0,13 mM
Vmax = 26  0,3 mM min-1
KM = 0,19  0,01 mM
kcat = Vmax / [Etot] = 26 / 0,13 = 206 min-1
SAGGI DISCONTINUI
Alcuni sistemi non possono essere saggiati in modo continuo
1) Perché durante la reazione non si formano o consumano cromofori o fluorofori
e le condizioni per far sviluppare colore o fluorescenza sono diverse da quelle del
saggio.
2) Non è possibile far sviluppare colore o fluorescenza. La misura del prodotto
(o del substrato consumato) devono essere fatte con altri sistemi, ad esempio HPLC,
saggi biologici o immunologici.
3) Presenza di un fondo ( background ) elevato; ad esempio di assorbanza dovuta
alle proteine in un estratto crudo o di altre molecole che assorbono alla lunghezza
d’onda che a noi interessa. In questo caso dobbiamo condurre il saggio e poi
eliminare la fonte di disturbo.
ESEMPI DI SAGGI DISCONTINUI
PRELIEVO DI ALIQUOTE
AD INTERVALLI DI TEMPO
ENZIMA
+
SUBSTRATO
REAZIONE
IN
CORSO
2a FASE
1a FASE
E1 + S  E1 + P
X
E2
La reazione viene bloccata con
acido, denaturanti delle proteine,
calore, inibitori dell’enzima
Il prodotto di reazione viene
quantificato con vari metodi
P-X metodi
colorimetrici
Quantificazione
con HPLC
Trasformazione in un composto che può
essere quantificato colorimetricamente o
in altro modo
Metodi radioisotopici
Esempio:
1a FASE
Glutamato 1-semialdeide (GSA)
2a FASE
GSA + DMBA     COMPOSTO COLORATO
5-aminolevulinato (ALA)
[GSA] = 1 mM
Pendenza = vi (mM s-1)
[GSA] = 0,7 mM
[GSA] = 0,5 mM
[GSA] = 0,4 mM
Metodi radioisotopici
• Si basano sull’utilizzo di forme radiomarcate di un substrato
• Sono metodi molto sensibili ma limitati alle applicazioni in cui è possibile
separare facilmente i substrati dai prodotti
Esempio: misura dell’attività di un’aminotrasferasi
R1
1a FASE
+H N
3
14
C
R2
COO-
+
H
C
R2
R1
COO-
14
O
C
+
COO-
O
+H N
3
C
COO-
H
Miscela
di
reazione
2a FASE
(separazione cromatografica
e conteggio della radiattività)
lavaggio
eluizione
colonna
cromatografica
a scambio anionico aminoacidi
chetoacidi
Conteggio
radiattività
METODI IMMUNOCHIMICI
L’utilizzo di anticorpi monoclonali o
policlonali, prodotti contro un particolare
enzima, può fornire la base per un dosaggio
enzimatico, basato sul metodo ELISA,
altamente specifico, in grado di distinguere
isoenzimi o enzimi diversi che catalizzano
reazioni identiche. Questi metodi sono di
notevole importanza diagnostica
Dosaggio immunometrico mediante
anticorpi marcati con enzimi
Enzyme-Linked Immunosorbant Assay
(ELISA)