Nessun titolo diapositiva - Corso di Laurea in Tecniche di

ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI
ANATOMIA PATOLOGICA
ESAME ISTOLOGICO :
ESAME CITOLOGICO :
•
esame estemporaneo
mediante uso del criostato
•
esame su versamento
interstiziale
•
biopsie mirate su tessuti e\o
su organi
•
esame su urine
•
esame su striscio vaginale
prelievi autoptici
•
agoaspirato
•
•
1
FASE PROPEDEUTICA
•
2
FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO
•
3
FASE PRE-ANALITICA
•
4
FASE ANALITICA
•
5
FASE POST-ANALITICA
•
6
FASE INTERPRETATIVA
•
7
REFERTAZIONE
1
FASE
PROPEDEUTICA
CITOLOGIA :
ISTOLOGIA :
•
richiesta esame da reparto
o
divisione
ospedaliera
interna o da medico esterno
•
richiesta esame da reparto
o
divisione
ospedaliera
interna o da medico esterno
•
allegate notizie cliniche e
patologiche
circa
la
motivazione della richiesta
di esame
•
allegate notizie cliniche e
patologiche
circa
la
motivazione della richiesta
di esame
•
contestuale invio di reperto
anatomico
o
istologico
(vetrini di consulenza)
•
•
esecuzione autopsia e relativi
prelievi effettuata dal medico
anatomo-patologo
contestuale invio di campione
citologico o di vetrino con
striscio vaginale già eseguito
dal ginecologo
•
(preparazione ed anamnesi
del paziente sottoposto ad
agoaspirato
in
apposito
ambulatorio)
2
FASE PROPEDEUTICA DI
LABORATORIO
ISTOLOGIA :
•
ricezione biopsie e reperti
•
classificazione e numerazione reperti
registro interno annuale progressivo
•
compilazione apposito modulo di profilo mirato
•
riduzione reperti anatomici ad opera del medico
apposite cassettine per istologia
•
procedura di
fissazione dei tessuti
automatico (autotecnico) (circa 15 h.)
•
(accensione e preparazione del criostato negli esami
estemporanei)
su
apposito
in
in processatore
3
FASE
PRE - ANALITICA
ISTOLOGIA :
• inclusione in paraffina
precedenza fissati
• preparazione
microtomo
termostatato stendi-sezioni
dei
reperti
e
in
bagno
• raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su
vetrini; loro fissazione in stufa a secco
termostatata;
procedimento
deparaffinazione in solventi
• (per esame al criostato : riduzione reperto e
taglio sezioni
con
loro
immediata
fissazione in metanolo)
4
FASE
ANALITICA
ISTOLOGIA :
• colorazione manuale o automatizzata delle sezioni
su vetrino
• colorazione di routine E.-E.
• colorazioni speciali
• reazioni specifiche di immuno-isto-chimica
• montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo
• (colorazione esame criostato)
• Controllo di qualità :
• uso di sezioni già risultate positive in qualità di
controllo positivo
• controlli inter-laboratorio
5
FASE
POST - ANALITICA
ISTOLOGIA :
• apposizione etichette identificative sui vetrini
contenenti le sezioni colorate
• archiviazione in apposite rastrelliere delle
cassettine
per istologia
contenenti le
inclusioni in paraffina
• consegna dei vassoi contenenti i vetrini e
dei moduli di profilo mirato al medico
anatomo-patologo specialista
• archiviazione dei
istoteche
vetrini
diagnosticati
in
6
FASE
INTERPRETATIVA
ISTOLOGIA :
• osservazione
ottico
dei
vetrini
al
microscopio
• interpretazione e diagnosi da parte
medico anatomo-patologo specialista
del
• refertazione su apposito modulo di profilo
mirato e relativa consegna in segreteria
amministrativa
• Controllo di qualità :
• lettura vetrini incrociata tra medico lettore e
medico revisore
• lettura alla cieca inter-laboratorio
7
REFERTAZIONE
• refertazione
su
amministrativa
•
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mod
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DOPO IL PRELIEVO
• -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e
come.
• -Tessuti sotto vuoto
• Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.
FISSAZIONE DEI TESSUTI
•
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rappresenti
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caratterist
Fissazione
Definizione
Trattam ento chim ico che porta alla immobilizzazione e alla
stabilizzazione di componenti tessutali con m inim a
dislocazione ed estrazione dei composti nativi
La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il
più possibile sim ile alla condizione vitale
Fissazione
Una fissazione ideale prevede:
• Stabilizzazione contro m odificazioni successive indotte da
trattam enti susseguenti quale l’inclusione in paraffina
• Sim ultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo
( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti )
• Rip roducibilità del processo di fissazione nonostante
diffe rente composizione del tessuto
• Assenza di “anorm ali” componenti prodotti o estrazione di
componenti native
• Rapidità di azione ( per evitare l’insorge re di autolisi )
• Assenza di “sovra-fissazione”
Fissazione dei Tessuti
• Mo lto im portante è lo spessore del cam pione di tessuto
che non deve , in genere , superare i 3 m m ,onde evitare che
al centro del tessuto intervengano fenomeni de generativi
prim a dell’a rrivo del fissativo.
• Una buona fissazione ,atto prelim inare più im portante della
tecnica isto lo gica , pena la perdita irreparabile del tessuto
dipende:
- dal tipo , dal p H e dalla concentrazione del fissativo usato ,
- dalla osmolarità e dalle fo rze ioniche in atto
- dalla tem peratura e dalla durata dell’in tera operazione
• In genere i fissativi più usati interven gono sulle proteine e
sui lip id i, m entre i glic id i, specie se a basso peso
molecolare , ven gono solo inclusi tra le proteine fissate e
possono diffondere nell’acqua.
Fissazione
Classificazione
I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per:
1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con
nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine
che reagiscono una con l’altra formando aggregati
MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria
3 Modi:  movimento termico con distruzione della struttura
secondaria e terziaria (calore)
 repulsione elettrostatica tra parti diverse di una
stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)
 rimozione di H2O con disidratazione (etanolo)
La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per
Cross-link
Fissazione
2) CROSS LINKING: ovvero la fo rm azione di legam i crociati
tra
polipeptidi all’in terno di una stessa proteina o tra proteine
vicine
STABILIZZANO la confo rm azione nativa della proteina
E’ un processo ADDIT IVO, più o m eno sensibile
Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE
Utile anche in ME, Is tochim ica
La Fo rm alina:
F
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T
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E’ il più diffuso ed usato fissativ o in istopatologia
, ad unv alore
di p
H prossim o a 7
.0 . La form alina div iene m ono
m erica ed
idratata
, unam olecola dib asso pesom olecolare capace di
penetrate rapida
m ente nei tessuti, con la form azione di gruppi
idrossi-m etile con le proteine
, e con la form azione di lega
m i di
tipom etilenico tra catene polipeptidic
h e(c ro ss-lin kin g )
•F o rm alin aa l1 0 %form aldeide polim erizzata in soluzione
ac
q uosa
al %
:1 0
( detta anc
h e
4%
)
:
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1
e
•F o rm alin as a la ta :1 00 m l di form aldeide al4 0 %
+9g diN aCl +
0
90m l diH
2
0;è una soluzione isotonica c
h e im pedis
coartazione ed il rigonfia
m ento cellulare
•F o rm alin an elta
m ponata :1 00 m l di form aldeide4 0
diH 20 +
4 g di fosfato acido di sodio +6
.5 g di fosfato d
anidro
; im pedisce l’ acidificazione dei tessuti( feno
m
alla trasform azione della form aldeide in acido form
Modi di Applicazione ( 1 )
Immersione
Il campione deve essere immerso in almeno
20 volte volume di fissativo
Ottima fissazione se:
• dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore)
• minimo intervallo tra asportazione e immersione
(< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo,
non sono più ossigenate e muoiono in un tempo
variabile)
Modi di Applicazione
Immersione
Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga )
e le dimensioni.
Importanti le indicazioni sul recipiente
(non sul coperchio)
Nome, data, Numero; provenienza
Modi di Applicazione ( 2 )
Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida
(aldeidi)
Dis tanza tra vasi e cellule: m ax. 100 m icrons
Diffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della
adeguata concentrazione nel tessuto.
Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta
dipende da:
• Concentrazione
• Temperatura
• Natura dl fissativo
• Topografia del tessuto in rapporto al fissativo
• Tipo di tessuto
• Cross Link o coagulazione
Modi di Applicazione ( 3 )
Esposizione di cellule e tessuti disidratati
(liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad
elevata temperatura ( 80°c )
Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare
amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)
Fissazione dei Tessuti
Fissativi alcolici
• Alcool etilico 95°
• Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti
• Alcool m etilico
• Alcool m etilico ed acetone anaparti
L
’ alcool di per sé
, per ilb asso potenziale di ossidazione e per la
m oderata capacità di penetrazione
, nonè unb uon fissativ oper
istologia( m aè meglio di niente) ;
determ ina eccessiv a
coartazione ed indurim ento dei tessuti, denatura le proteine e
coagula grossolana
m ente il citoplas
m a
; pertanto si preferisce
utilizzarlo in associazione con altre co
m ponenti onde ottenere un
fissativ o più efficace ed o
m ogeneo
.
Siè soliti ricorrere all’ alcool etilico 5
9 ° o all’ alcool etilico5 0 ° in
egualv
olum e alm a
teriale prele
v ato com e prefissaggio in
citologia
.
Fissazione dei Tessuti
Miscele fissatrici a base di alcool:
• Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool
etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40%cui si
aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale
• Liquido di Carnoy: costituito da 6parti di alcool
etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido
acetico glaciale
• Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool
etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale
• Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9parti
di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%
Fissazione dei Tessuti
Miscele fissatrici a base di acido picrico:
•Liqu ido di Bouin: composto dalla m iscela di 15 parti di
acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di
fo rm aldeide 40%ed 1 parte di acido acetico glaciale
•Liqu ido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 m l di alcool
etilico 80°, 60 m l di fo rm aldeide 40%, 15 m l di acido
acetico glaciale ed 1 g di acido picrico
En tram bi sono fissativi m olto penetranti; tu ttavia , la
presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo
ad eventuali inda gini retrospettive e d i estrazione del DNA
e , ino ltre , scio glie facilm ente la m aggio r parte delle
calcificazioni presenti.
Rischi e precauzioni d’uso per i
fissativi
Fo rm aldeide : Po tenziale allergenico (cancerogenicità) per
inalazione e contatto.
Uso di cappe aspiranti.
Alcool : Rischio incendi
Glu taraldeide
Ac . Picrico
Sa li di Me rcurio
Tetrossido di Osm io
Im portante: uso di arm adi dedicati e quantità lim itate.
Tempi d’uso per i fissativi
Fo rm aldeide 4%(= Fo rm alina 10%)
Ve locità di penetrazione = 0,5 cm in 24
Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim . del frammento, da
3h a 24h
Alcool etilico 95%: penetra lentam ente nei tessuti freschi
Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti
piccoli ( diam 1-2 mm)
INCLUSIONE DEI TESSUTI
Tecnica di inclusione in paraffina :
• Si effettua di routine su campioni privi di problemi
particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono
solubili e si asportano dai tessuti i grassi.
• La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è
chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che
devono essere disidratati con immersione in alcool
etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della
paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di
venire impregnati in essa e successivamente inclusi in
blocchetti.
• In genere, il processo di inclusione avviene mediante
l’ uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore
notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per
ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il
tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi
microtomi.
Disidratazione
ETANOLO
METANOLO
ACETONE
PROPANED IOLO
Chiarificazione
XILOLO
BENZOLO
CLOROFORMIO
Inclusione
Paraffina
Gelatina / Agar
Celloidina
• Id rosolubili
Resine
(Me tacrilati)
• Epossidiche
Congelamento dei tessuti
•
Effetti del congelamento
Sostanze “Pro tettive”
• Glicerolo / DMSO
• Blocchi di m etallo
• Produzione di “Neve CO2”
•
Metodi di congelamento
• Gh iaccio secco
• Appar. Term o-e lettrici
• Gas liqu idi (N2)
METOD O ID EALE
FREON
ISOPENTANO
Conservazione di
tessuti e cellule
METODI RAPIDI
Metodo
T (°C)
Efficienza
a
Tessuti
in liqu idi
refrige rati
Tessuti
in contatto di
metalli
refrige rati
Fluido organico
In gas liquido
(N2)
- 196
Il più veloce
Fluido organico
In ghiaccio secco
Liquido organico b
- 79
Ottimale per la
maggior parte delle
applicazioni in M.O
Raffreddamento
Termo-elettrico
- 40
scarsa
Supporto metallico
Raffreddato per
conduzione
- 30
scarsa
a
a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano
b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone
Sezionamento
Rischio
• Microtomo
• Criostato
ambientale
•
Temp. ideali per i vari
tipi di tessuto
•
Lam a
•
Tratt. delle sezioni
1) Essicamento (+fissazione)
2) Freeze drying o altri metodi
• Ultra-microtomia
M.E.
Freeze – Drying
(Liofilizzazione)
• Principi
• Condiz. di conge lam ento
• Applicazione ai tessuti
• Condiz. di liofilizzazione
Temp.
Tempo
Trappola di N2O
• Trattamento successivo
Inclusione in paraffina
Fissazione in vapori
Freeze – Sobstitution
SPARAFFINATURA DELLE SEZIONI
Tecnica di preparazione
delle sezioni in paraffina,
di circa 3 µ, per
essere
colorate :
E’ un procedimento atto
ad
assicurare
che
la
paraffina, non miscibile con
acqua ed alcool, venga
eliminata
ed il tessuto
possa essere impregnato
dal colorante. Quindi è
necessario utilizzare dei
solventi della paraffina ed
idratare gradualmente il
tessuto sino
all’
H2O
distillata. Nel caso in cui il
colorante sia in soluzione
alcoolica ci si arresta all’
alcool 95°.
•
xilolo
5’
•
xilolo
5’
•
xilolo
5’
•
etanolo 100° 5 ’
•
etanolo 100° 5 ’
•
etanolo 100° 5 ’
•
etanolo 95°
5’
•
etanolo 70°
5’
•
etanolo 50°
5’
•
H2O distillata ––›
•
––› colorazione
Colorazione dei tessuti
• Composizione (Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O
/ - S/ -NH3)
• Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi
• Ionico (Salino – elettrostatico)
• Tipo di legame
tra colorante e tessuto
• Covalenti (tra non metalli = elettroni
condivisi tra due atomi)
• Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff
(atomo centrale con 1 o 2 legami)
es Ag. Diammina
• Intermolecolari (van der Waal)
Colorazione dei tessuti
• Co lorazione di m acromolecole sulla base di cariche (ioniche)
• Basofile
• Com ponenti tissutali
• Ac idofile
• Neutrofile
• Co loranti
• Ca tionici (basici)
• An ionici (acidi)
COLORANTI : DEFINIZIONE
CROMOGENO ( Luce visibile 400-800 mm)
Criteri di purezza
Spettro
Gruppi cromofori
-N  -N azo
N = O nitroso
N - O2 nitro
NOMENCLATURA
c=c
alkene
c=o
oxo
(gruppi auxocromi)
es: -SH
coloranti
NIT RO
AZO
CHINONICI
Pratica di colorazione dei tessuti
Reattivi
Purezza
Technical quality
Pu rified / Pu re / Ve ry pure
Analytical grade
Acqua
Etichetta sui reattivi
Conservazione
Scarto / Scaricamento
Coloranti
(Assorbimento
Coloranti cationici
colore osservato)
Nuclei / Batteri
pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di
fosfato DNA / RNA (selettivo)
es. col. GRAM
ZIEL-NIELSEN
+Cresyl-v ioletto +I2
- col. Rosso = Fucsina
Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)
· EMATEINA
ossidazione di ematossilina
Compl. con AL
Fe
EMALLUME
(Mayer - Carazzi)
EMAT. HARRIS - Lillie
progressive - Differenziazione
Ematossiline
regressive
- pH
Colorazione dei tessuti
Reazione di Blocco
• Ossidazione
-
Ossidanti
Deboli
H2O2 / I2
Medi
Ac . Pe rfo rm .
Fo rti
Pe rm anganato
• Riduzione
• Ac ilazione / Alchilazione (fo rm . di derivati acidi)
• Saponificazione (id rolisi di derivati acidi
• Deam inazione
COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA
Ematossilina - Eosina
•
sezioni in H2O distillata
•
Emallume acido di Mayer,
filtrato,
7’
•
lavare H2O di fonte
10’
•
soluzione satura Li2CO3 15”
•
lavare H2O di fonte
10’
•
Eosina [0.25%
], acidificata con
qualche goccia di CH3COOH
1’
•
lavare in H2O distillata
2’
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso
Colorazione con coloranti basici
La colorabilità dipende da vari fattori:
• pH
• disidratazione
• fissazione
• temperatura
Colorazione con coloranti basici
• p H della soluzione
• Tipo di colorante
Dipende da:
• Tempo e tem peratura
• Tampone
• Trattam ento dopo la colorazione
Meccanismo:
• Aggrega ti di coloranti lega ti a
gruppi acidi
• Le gam e ionico +f. van der Waal
es. Blu di Toluidina
Metacromasia
Vis ibile
U.V.
Alcool
resist.
+
-
PAS
H
C
OH
H
C
OH
H
C
O
H
C
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“ALCIAN BLU pH 2.5”
•
sezioni in H2O distillata
•
lavare in H2O distillata
5’
•
soluzione Alcian blu 8 GX
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
4’
[1%in CH3COOH 3%
]
30 ’
•
lavare in H2O distillata
5’
•
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1%]in
solfato
di
alluminio [5 %] a
caldo e filtrato] )
2-3’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine
acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di
fondo rosa tenue
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“PAS (acido periodico di Schiff) e PAS
Diastasi”
•
sezioni in H2O distillata
•
alcune
sezioni
possono
essere pre-trattate
con amilasi (diastasi) [0.1%in PBS]
a 37°C
30 ’
•
•
contrasto
nucleare
con
emallume
5’
lavare in H2O di fonte
15
’
•
HIO4 (acido periodico) [0.5 1%in H2O distillata]
15 ’
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
lavare in H2O distillata
’
•
disidratare in etanolo 100°
4’
•
reattivo
di Schiff (fucsina
solforosa)
45 -60 ’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
lavare in metabisolfito di
sodio [5%
]
2’
•
montare in mezzo d’inclusione
•
•
lavare in H2O di fonte
5
15’
(3 cambi)
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glicoproteine
neutre
rosso
magenta.
Dopo
pretrattamento con diastasi il glicogeno non
si colora
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“ALCIAN - PAS (VIALLI)”
•
sezioni in H2O distillata
•
lavare in H2O distillata
10’
•
soluzione Alcian blu 8 GX
•
contrasto
nucleare
ematossilina Carazzi
’
con
5
•
lavare in H2O di fonte
’
15
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
[1%in CH3COOH 3%
]
30 ’
•
lavare in H2O distillata
5’
•
HIO4 (acido periodico) [0.5 1%in H2O distillata]
15 ’
•
lavare in H2O distillata
’
•
reattivo
di Schiff (fucsina
solforosa)
45 -60 ’
•
lavare in metabisolfito di
sodio [5%
]
2’
5
Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine
acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e
sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene
rosso; colorazione citoplasmatica di fondo
rosa tenue; altre strutture giallo
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DELL’ OIL RED O x I LIPIDI”
•
sezioni in H2O distillata
•
immergere in alcool isopropilico 60%
•
soluzione di Oil Red O [0,5%in 200 ml di alcool
isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata
20’
•
differenziare in alcool isopropilico 60°
20”
•
lavare in H2O di fonte
5’
•
eventuale colorazione nucleare con ematossilina
5’
•
lavare in H2O di fonte
•
montare in glicerina e lutare
Risultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo
rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuro
5’
10’
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI”
•
sezioni in H2O distillata
•
immergere in alcool etilico 55 °
•
soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 °
40’
•
differenziare in alcool etilico 55°
20”
•
lavare in H2O di fonte
•
montare in glicerina e lutare
Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale
metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi
grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i
proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia
ben differenziato dal colore dei lipidi
5’
5’
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO AL SUDAN III e SUDAN IV”
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
immergere in alcool etilico 70 °
5’
soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico70 ° ed
acetone in parti eguali
10’
differenziare in alcool etilico 50°
lavare in H2O di fonte
Emallume acido di Mayer, filtrato,
lavare in H2O di fonte
montare in glicerina e lutare
Risultati : lipidi neutri da rosso ad arancio;
nuclei blu - scuro
20”
5’
7’
5’
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“ORCEINA x FIBRE ELASTICHE”
•
sezioni in H2O distillata
•
immergere
in
soluzione
contenente Orceina [1 g+ 0.4
ml acido nitrico + 100 ml
alcool etilico95 °]
24 h
•
soluzione acquosa di acido
fosfomolibdico [5 %]
20’
•
lavare H2O distillata
•
soluzione
contenente
:
[Orange G 2 g + verde luce 0.2
g +CH3COOH 2 ml /100 ml H2O
distillata]
10’
10’
•
lavare l’ eccesso di colorante
in alcool etilico 85 °
2’
•
lavare H2O distillata
10’
•
lavare H2O di fonte
5’
•
colorare
con
miscela
contenente : [0.35 g Blu di
alizarina acido + solfato di
alluminio 10 g / 100 ml H2O
distillata]
10’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
•
lavare H2O distillata
10’
Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro;
fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre
collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina
arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO”
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
ossidare in permanganato di
K
(
KMnO4
)
5’
lavare in H2O di fonte
5’
soluzione di acido ossalico
(C2H2O4)
1’
lavare in H2O di fonte
5’
mordenzare in Allume ferrico
[2%
]
5’
lavare in H2O di fonte
5’
lavare in H2O distillata
soluzione di Argento nitrato
(AgNO3) ammoniacale [10%] al
buio
5 - 8’
lavare in H2O distillata
sviluppare in soluzione di
formalina [10%
]
3’
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
lavare in
H2O di fonte
5’
lavare in H2O distillata
differenziare in Cloruro oro
(HAuCl4) [1%
]
8 - 10’
lavare in sodio tiosolfato
(Na2SO2O3) [5%
]
5’
lavare H2O di fonte
5’
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1%] in
solfato di alluminio [5 %] a
caldo e filtrato] )
2-3’
lavare H2O di fonte
5’
disidratare in etanolo95°
4’
disidratare in etanolo 100° 4’
(3 cambi)
chiarificare in xilolo (3 cambi)
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno
scuro; nuclei rosso intenso
N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“ELASTIC - VAN GIESON”
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
ossidare con soluzione di
KMnO4 (permanganato di K)
5’
lavare H2O di fonte
5’
soluzione di C2H2O4 (acido
ossalico)
1’
lavare H2O di fonte
5’
soluzione
di
Weigert
(resorcina - fucsina) a 60° C
120’
lavare H2O di fonte
10’
Emallume acido di Mayer,
filtrato,
3’
•
•
•
•
•
•
•
•
•
lavare H2O di fonte
10’
soluzione satura Li2CO3 15”
lavare H2O di fonte
10’
soluzione
di Van Gieson
(fucsina acida [1%] 5 ml+ acido
picrico 95 ml)
3’
lavare H2O di fonte
5’
disidratare in etanolo95°
4’
disidratare in etanolo 100° 4’
(3 cambi)
chiarificare in xilolo (3 cambi)
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero;
collagene rosa - rosso; connettivo giallo;
nuclei blu scuro
MICROSCOPIA ELETTRONICA
• La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza
d’ onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone
elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt)
che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti
elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre.
• M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di
ottenere l’ immagine elettronica, riprodotta su lastra
fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di
una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti
possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni.
• M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di
ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie
di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo
il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come
un pennello elettronico. L’ immagine si ottiene direttamente
su tubo a raggi catodici. L’ ingrandimento finale è da 20 a
100.000 x.
• Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le
sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in
Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e
colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato
di Piombo), onde aumentare il contrasto dell’ immagine.
MICROSCOPIA ELETTRONICA
“METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI”
•
•
•
•
•
•
•
•
•
fissare un frammento di 1 mm3 in
glutaraldeide [2.5 %]
in buffer
cacodilato o in PBS a 4 °C
2-6 h
lavare in PBS (3 cambi)
10’
post-fissazione in tetraossido di
osmio [1.30 %] a 4 °C
2h
lavare in PBS
20’
disidratare i campioni in serie
ascendente di alcool
2-3 h
chiarificare in toluene o in ossido di
propilene
1h
resina epossidica EPON + toluene [1 :
1]
RT
12 h
resina epossidica EPON RT
12 h
inclusione in capsule di gelatina o di
plastica e polimerizzazione in stufa a
60 °C
48 h
•
•
•
•
•
•
•
•
taglio delle sezioni ultra-sottili
con ultra-microtomo con lama di
cristallo o di diamante
le
sezioni,
di
spessore
appropriato, vengono raccolte su
dei retini di rame circolari e di 3
mm di Ø
colorare con acetato di uranile in
soluzione acquosa satura
10’
lavare in H2O distillata
colorare con citrato di piombo
10’
lavare in H2O distillata
far seguire la disidratazione
secondo le tecniche usuali
osservare al M.E.
Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e
maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco
e nero e\o con tonalità di grigio.
Citologia
Finalità
Necessità di ottimale fissazione e
colorazione delle varie componenti
Modalità di preparazione
Preparati citologici
• Ce rvice uterina
• Striscio - Spatole
• Citocentrifu ga ti
• Urine
• Ve rsamenti
• Bronchi
• Spazzolati
• Vie bilari
• Po lm one
• Mammella
• Tiroide
• Lin fonodi
• Agoaspirati
• Microbiopsie
Citologia
• Au tom atica
• Strisci
• Analisi d’immagine
• Citom etria di flusso
• Ago
• Spatole
• Anse
• Citocentrifu ga
• Centrifu gazione liqu idi
• Inclusione di sedim enti
Filtri Millipore
Agoaspirati
Sedim enti
Fissazione
Principali Fissativi
Inclusione
Alcool
O
Fo rm alina
H- C
H
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“PAPANICOLAOU”
•
sezioni in H2O distillata
•
Colorare in Orange G6
•
Ematossilina di Harris,
filtrata,
3’
•
etanolo95° (2 cambi)
•
lavare H2O di fonte
5’
•
Colorare in EA 50
•
soluzione alcool - acida a
pH 3 (etanolo70°+HCl) 10”
•
etanolo95° (2 cambi)
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
2’
3’
20”
3’
20”
•
lavare H2O di fonte
•
soluzione satura Li2CO3 15”
•
lavare H2O di fonte
10’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
soluzione di etanolo 70°
2’
•
•
soluzione di etanolo95°
2’
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante
tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosaarancione\rosso chiaro (eosinofilia)
Col. Papanicolau
Vantaggi ed eventi determinanti
• -Definizione dei
dettagli nucleari
• -Corretta fissazione
• -Buona col. Nucleare
• -Trasparenza
citoplasmatica
• -Coloranti con sol.
altamente alcooliche
• -Adeguata
diafanizzazione
• -Differenziaione dei
vari tipi cellulari
• -Colorazione
policromatica
Problemi di colorazione con
Papanicolau
1)Coloraz. Nucleare pallida
-Insufficente rimozione di
“fissativi a pellicola” (polietilenglicole+alcool etilico)
-azione decolorante di HCl
-striscio parzialmente asciugato
prima della fissazione
Problemi di colorazione con
Papanicolau
1)Coloraz. Nucleare pallida (2)
-pH dell’acqua corrente
poco alcalino
-colorante troppo vecchio
Problemi di colorazione con
Papanicolau
2)Coloraz. Nucleare troppo intensa
-fissazione con alcool >95%
-tempo di immersione in HCl
troppo breve
-striscio troppo spesso
che trattiene il colore
(N.B. è possibile decolorare)
Problemi di colorazione con
Papanicolau
3)Coloraz. Citoplasmatica
insoddisfacente
-permanenza in alcool70%
troppo lunga = decolorazione
-asciugatura dello striscio prima
della fissazione = tutto rosa
Problemi di colorazione con
Papanicolau
3)Coloraz. Citoplasmatica
insoddisfacente
-striscio di alterno spessore
-tempo di coloraz. scarso o non
scuotimento del cestello
-scarsa col. con verde luce =
sostituire o pH non 4,5-5
Problemi di colorazione con
Papanicolau
4) Riscio di inquinamento e
trasporto di cellule
-filtrare i coloranti
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“GIEMSA”
•
sezioni in H2O distillata
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
Giemsa puro diluito in H2O
al [10 o 20%
]
60’
•
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
differenziare in CH3COOH
diluito (0.4 ml acido acetico
glaciale \ 100 ml H2O)
10”
•
lavare in H2O distillata
•
differenziare in etanolo 95°,
controllando al microscopio
10”
•
arrestare la differenziazione
con alcool iso-propilico
2’
(3 cambi)
effetto Giemsa : produce una
particolare colorazione viola rossastra della cromatina del
nucleo a causa dell’ eosinato
di Azur.
La soluzione di Giemsa pura
è
formata
da
eosinato
di Azur II, contenente eosinato
di Azur B ed eosinato di
blu di
metilene
sciolti
anaparti.
Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile
rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto
* specialmente elettiva per le cellule del sangue *
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“GIEMSA modificato”
• sezioni fatte
all’aria
• post-fissazione
metanolo
essiccare
in
15’
• lavare in H2O di fonte 5’
• soluzione di Giemsa puro
diluito al [15%] in buffer
fosfato a pH6.8 (22 ml 0.5
M Na2HPO4 + 32 ml 0.5 M
KH2PO4 / 1000 ml H2O
distillata)
15’
• lavare in H2O distillata
(3 cambi)
• fare asciugare a secco
• chiarificare
cambi)
in
xilolo
(3
• montare
in
mezzo
d’inclusione (Entellan
o
balsamo Canada)
Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile
rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto
(eseguito specie su strisci)
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“GRAM”
•
sezioni in H2O distillata
•
cristalvioletto
metile [1%
]
•
scolare eccesso di colorante
•
soluzione di Lugol
•
lavare in H2O di fonte
•
differenziare in soluzione di
alcool - acetone
20”
•
lavare in H2O di fonte
•
fucsina basica
neutro [1%
]
•
lavare in H2O di fonte e
tamponare con carta bibula
o
•
violetto di
1 - 2’
3 0”
o
disidratare in etanolo 100° 1’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
rosso
1 - 2’
Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri
Gram - rosso; colorazione di fondo rosa
N. B. : porre attenzione alla differenziazione
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“ZIEHL - NEELSEN (KOCH)”
•
sezioni in H2O distillata
•
fucsina basica [10 ml di
soluzione al 10 % in etanolo
100 °] in acido fenico [+100
ml fenolo 5%in H2O distillata e
filtrato]; flambare le sezioni
sul bunsen sino a farle
fumare
•
lavare in H2O distillata
•
differenziare in soluzione
alcool - acida [HCl
3% in
etanolo 70°] finché le sezioni
non cedono più colore
•
lavare in H2O di fonte
•
blu di metilene
distillata]
•
lavare in H2O di fonte
•
disidratare in etanolo 100°
sino a che le sezioni non
divengono blu pallide
2’
[1% in H2O
5 - 10 ’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
10 ’
Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso;
flora batterica e tessuti vari blu
N. B. : porre attenzione alla differenziazione
INCLUSIONE DELLE CELLULE
Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina :
E’ un procedimento atto ad assicurare che tutto il
materiale cellulare sia conservato durante i passaggi
analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina
così da renderle compatte e non dispersibili.
• celloidina 10%: sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in
50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere
(conservare in recipiente di vetro ben sigillato)
• riempire di celloidina 10% una provetta in propilene,
svuotarla, capovolgerla per allontanarne l’ eccesso onde
ottenerne uno strato di 20 - 50 µ. di spessore (cell - bag)
• riempire la provetta di cloroformio che indurisce la
celloidina e svuotarla di quest’ ultimo prima dell’ uso
• riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare
e centrifugare
• allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l’ alloggiamento
nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.
COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA
Ematossilina - Eosina
•
sezioni in H2O distillata
•
Ematossilina di Harris,
•
•
filtrata,
3’
lavare H2O di fonte
5’
soluzione alcool - acida a
pH 3 (alcool70°+HCl)
10”
•
lavare H2O di fonte
2’
•
soluzione satura Li2CO3 15”
•
lavare H2O di fonte
10’
•
Eosina [0.25%
], acidificata con
qualche goccia di CH3COOH
1’
•
lavare in H2O distillata
2’
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro;
citoplasma ed emazie rosa-rosso.
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI”
•
sezioni in H2O distillata
•
sodio tiosolfato [3%
] 2-3’
•
ossidare le sezioni in HIO4
[0.5%in H2O distillata] 15 ’
•
lavare in H2O di fonte
•
lavare in H2O distillata
’
•
verde di metile [1%
] 5 - 10 ’
•
disidratare in etanolo95°
•
disidratare in etanolo 100° 4 ’
•
5
mettere le sezioni al buio a60
°C nella soluzione argentica
pre-riscaldata (10 ml di
metenammina [3%]+ 0.5 ml di
AgNO3 [5 %] + 1.2 ml
di
Borace [5%
]) 60 -90 ’
•
lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
•
HAuCl4 (cloruro oro) [1%
]
2-3’
5 - 10 ’
4’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“ARGENTO - METENAMMINA - PAS”
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
soluzione Ammoniaca [2%]in
etanolo95°
overnight
ossidare le sezioni in HIO4
[0.5%in H2O distillata] 15 ’
lavare in H2O distillata
5
’
mettere le sezioni al buio a60
°C nella soluzione argentica
filtrata e pre-riscaldata : (25
ml H2O distillata + 2 ml di
Borace [5%] +25 ml soluzione
stock
:
(100
ml
di
metenammina [3%] + 5 ml di
AgNO3 [5%])
controllare al
microscopio
30’ - 40 ’
lavare in H2O distillata
5
’
HAuCl4 (cloruro oro) [0.2%]
2-3’
lavare in H2O di fonte
5’
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
sodio tiosolfato [2%
] 2-3’
lavare in H2O distillata
5’
liquido di Bouin a 60 °C 30’
lavare in H2O di fonte
10’
lavare in H2O distillata
5’
soluzione
di
acido
Fosfotungstico [2%
]
1 - 2’
lavare in H2O di fonte
10’
soluzione di cromotropo 2 R :
(100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g.
cromotropo 2 R)
15 ’
lavare in H2O distillata
5’
disidratare in etanolo95° 3 ’
disidratare in etanolo 100° 3 ’
(3 cambi)
chiarificare in xilolo (3 cambi)
montare in mezzo d’inclusione
neutro
Risultati : miceti in nero; membrane basali in
nero; background in rosso
COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DI MANN - DOMINICI”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione di Lugol
•
decolorare in iposolfito di
sodio [5%
]
2’
5’
•
soluzione di blu di toluidina
[0.5%
]
2 - 3’
•
lavare in H2O di fonte
•
differenziare in CH3COOH
sino a che le sezioni virano
al rosa
3’
•
lavare in H2O di fonte
•
lavare in H2O distillata
•
disidratare in etanolo95°
•
soluzione Dominici (Orange
G [1%]+ eritrosina [0.2%]+ 0.05
ml CH3COOH)
10 - 15’
•
disidratare in etanolo 100° 4 ’
•
lavare in H2O di fonte
•
lavare in H2O distillata
5’
5’
4’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili
rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti
basofili blu
elettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed
i midolli
COLORAZIONE IN CITO-GENETICA
“METODO ALL’ ORCEINA ACETICA”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione contenente Orceina acetica [ 2%](90 ml CH3COOH puro+2 g orceina+
100 ml H2O distillata
•
lavare in CH3COOH [45%
]
•
lavare
in
30’
1’
alcool
butilico
terziario
2’
•
soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)
Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porpora
una variante con l’ aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati
passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la
cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in
verde chiaro.
2’
Microscopia a fluorescenza
Piccole quantità
Fluorescenza
Illum inazione con luce a  breve
Em issione nel visibile
Filtri
Eccitazione / Sbarram ento
Fluoroforo
Ca ratt. Spettro di Assorbim ento
(Fluorocromo)
Ca ratt. Spettro di Em issione
Fosforescenza
Tipi di Fluorescenza
• Au tofluorescenza
- fibre elastiche
- NADH2
- Vit. A
- LIPOFUSCINE
- Porfirine
Tetracicline
Adriamicina
- Farmaci
Chinacrine
Benzopirene
O
• Fluorescenza indotta - Amine biogane+C
H
 carboline
N
• Fluorocrom i
DNA
- effetto “QUENCNING” - vantaggi caratteristici
ACRIDINE ORANGE (verde)
METACROMASIA
A.O.
Citologia
RNA
concentrazione
Rosso
polimeri
1 maggiore
METACROMASIA MASCHERATA
Reagenti di SCHIFF
Fluorescenti
ALDEIDI
FUCSIN A BASICA( para-rosanilina
)
Tioflarina T
AMILOID
E
PROCIO
N
yellow
BA
N E
D GGIO CROMOSOMICO COL
. SOPRAVITAL
E
cellule
( neuroni)
cell sorting
XN O
E
N
E RCURIO
M
IMMUNOFLUORESCENZA
Lam pade
Problem i di DECADENZA
FOT OGRAFIA
Liq. di m ontaggio
VET RI
Gruppi reattivi dimostrabili su sezioni
• Importanza in patologia diagnostica
Acidi Nucleici
• Coloraz. con coloranti basici
•M.O. Ordinaria
•M. Fluorescenza
(Acridina Orange)
Metacromasia
• Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria)
• Controlli con trattamento enzimatico (RNAs i - DNAs i)
• Reaz. Di FEULGEN
Metodi per la dimostrazione
di acidi nucleici
· Metodi qualitativi
quantitativi
· Interesse in patologia
· Distribuzione del DNA
· Met. Feulgen
VIRUS
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)
• CROMO-GALLOCIANINA
• Reaz. di FEULGEN
per legame purina - Desossiriboso
Idrolisi acida
Formaz. di gr. aldeidici
Frammentazione del DNA
Concentrazione
HCl
Temperatura
Sensibilità
Specificità di
- reazione
- localizzazione
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“FEULGEN reazione”
•
sezioni in H2O distillata
•
idrolisi in HCl 1 N a 60 °C
per un tempo ottimale in
relazione al fissativo usato
da 4’ a 25’
(usare anche HCl
RT)
•
5 N a
(10’)
•
lavare in HCl 1 N freddo e
poi in H2O distillata
•
reattivo di Schiff
•
lavare
in metabisolfito di
sodio [5%
]
2’
•
40’ -60’
lavare in H2O di fonte
15’
contrasto citoplasmatico con
verde luce [1%
]
•
lavare
in
H2O
1’
di
fonte
2’
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
4’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : il DNA si colora in modo elettivo in
rosso magenta; citoplasma verde
Metodi per la dimostrazione
di acidi nucleici
· Metodi qualitativi
quantitativi
· Interesse in patologia
· Distribuzione del DNA
· Met. Feulgen
VIRUS
Valutazione quantitativa
Principi
Luce
Cell
Variazione di assorbimento
Lunghezza d’onda
Metodi alternativi
BRDU
TIMIDINA TRIZIATA
- Ibridizzazione in situ
- Immunocitochimica
- Autoradiografia
- Citofluorimetria
cell sorter
Laser
Autoradiografia
• Principi
• Potere di risoluzione
• Stripping
• Emulsione
• Marcatori H3 / P4 / S
Tempo di Esposizione
• Timidina H3
• Principi
• Ibridizzazione in situ
• Legame di affinità
(Conteggio granuli / fondo)
Ibridizzazione in situ (ISH)
• Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH)
• mRNA specifico - gene espressione
(vantaggi rispetto a ICC)
• RNA / DNA virale
• Metodi - Sonde
Riboprobes Ma rcatura - Ra idoatt.
Oligos
Au to-radiografia
-S
-H
- pH
Non radioatt.
• Bio tina
• Digo xiganina
• Fluorescina
ICC
IBRIDIZZAZIONE IN SITU
ISH
• Questa
tecnica
consente di
identificare
specifiche
sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule
tali sequenze sono espresse.
• La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del
DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100°C, o esposta
ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi
ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari
[IBRIDIZZAZIONE].
• Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere
visibile
l’ avvenuta
ibridizzazione di
doppie eliche
neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso
complementari.
• La
marcatura
del DNA avviene
chimicamente
per
inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull’ anello della
Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi
con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la
fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5’).
• Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di
positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi
evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.
Ibridizzazione in situ (ISH)
• Sensibilità
• Problemi
• Localizzazione (Definizione)
• Conservazione strutturale
• Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni
• Sistemi laser / catapulta
(necessità di identificazione del tipo di cellule)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DI GOMORI PER LA MELANINA”
•
sezioni in H2O distillata
•
sodio tiosolfato [3%
] 2-3’
•
trattare in soluzione di Lugol
10’
•
lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
•
lavare in H2O distillata
•
•
mettere le sezioni al buio a60
°C nella soluzione argentica
pre-riscaldata (10 ml di
metenammina [3%]+ 0.5 ml di
AgNO3 [5 %] + 1.2 ml
di
Borace [5%])
60’
-90 ’ o 18-24 h. al buio RT
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1%] in
solfato di alluminio [5 %] a
caldo e filtrato] )
2-3’
•
disidratare in etanolo95°
•
disidratare in etanolo 100° 4 ’
5’
4’
(3 cambi)
•
lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
HAuCl4 (cloruro oro) [1%
]
2-3’
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : granuli di melanina nero; cheratina
arancio; nuclei rosso intenso
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“PERLS x IL FERRO”
•
sezioni in H2O distillata
•
5’
•
lavare H2O di fonte
soluzione di
di K [10%
]
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
soluzione di Ferrocianuro K
[10%]+ HCl [10%
] (70 ml+30 ml)
25’
•
disidratare in etanolo 100°
4’
Ferrocianuro
5’
•
•
lavare H2O di fonte
lavare H2O distillata
•
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1%]in
solfato di alluminio [5 %] a
caldo e filtrato] )
2-3’
5’
(3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : i depositi di ferro si colorano in
blu; i nuclei in rosso intenso
N. B. : non utilizzare strumenti metallici
(pinzette)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“PER IL RAME”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione
di
lavoro
di
Rhodanina [0.3 % in etanolo
100°] (6 ml / 100 ml H2O
distillata) a 60° C 120 - 180’
•
•
lavare H2O di fonte
lavare H2O distillata
•
contrasto
nucleare
ematossilina Carrazzi
•
lavare H2O distillata
•
lavare
in
soluzione
di
Borace [0.5%] (tetraborato di
sodio)
2’
•
lavare H2O distillata
•
disidratare in etanolo95°
4’
5’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
con
1’
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
Risultati : depositi di rame color rosa - rosso;
nuclei blu scuro
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione acquosa di AgNO3
(nitrato Argento) [3%
] 60’
•
sviluppare in una soluzione
di idrochinone [0.5%
]
3’
•
lavare H2O di fonte
•
•
•
•
contrasto nucleare con NFR
(rosso nucleare neutro [1%] in
solfato di alluminio [5 %] a
caldo e filtrato] )
2-3’
•
lavare H2O di fonte
5’
•
disidratare in etanolo95°
4’
fissare in una soluzione di
tiosolfato di sodio [5%
] 3’
•
disidratare in etanolo 100°
(3 cambi)
4’
lavare H2O di fonte
lavare H2O distillata
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione
(Entellan o balsamo Canada)
5’
5’
Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati)
nero; nuclei rosso intenso
N. B. : non utilizzare strumenti metallici
(pinzette)
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“DI FOUCHET x LA BILE”
•
sezioni in H2O distillata
•
lavare H2O distillata
•
soluzione
di
lavoro
secondo
Fouchet : (acido Tricloroacetico
(C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro
ferrico (FeCl3) [10%
]( 5 ml)
5 - 10 ’
•
disidratare in etanolo95°
4’
•
disidratare in etanolo 100°
4’ (3 cambi)
•
chiarificare in xilolo (3 cambi)
•
montare in mezzo d’inclusione (Entellan
•
•
lavare H2O distillata
soluzione
di Van Gieson (fucsina
acida [1%] 5 ml+ acido picrico 95 ml)
3’
o balsamo Canada)
Risultati : biliverdina color verde; collagene
rosa - rosso; connettivo giallo
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
“LUXOL FAST BLUE”
•
sezioni in H2O distillata
•
soluzione di Luxol Fast
Blue 2 G [0.1% in alcool
isopropilico]
60’
•
disidratare
in
alcool
isopropilico assoluto
5’
(3 cambi)
•
chiarificare
cambi)
•
montare
in
mezzo
d’inclusione (Entellan
o
balsamo Canada)
in
xilolo
(3
Tale
colorazione, sebbene
poco specifica
per
i
fosfolipidi, li colora in modo
soddisfacente, specie
se
disciolti
in
alcool
isopropilico e quindi fornisce
ottima
colorazione
della
mielina
integra (costituita
dalla
membrana
cellulare
della cellula di Schwann).
Risultati : la mielina appare in blu
COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA
ISTOCHIMICA - ENZIMATICA :
“CLORO - ACETATO ESTERASI”
•
•
•
•
•
•
PREPARAZIONE SOLUZIONI
sol. A : Naftolo AS-D
Cloroacetato [10 mg.] +
Dimetilformamide [1 ml.]
sol . B : buffer fosfato0.1 M
[30 ml.]
sol. C : Pararosanilina - HCl :
Pararosanilina idrocloride [2
g.] + HCl 2n [50 ml]
(sciogliere
a
caldo,
raffreddare e filtrare)
sol. D : Sodio Nitrato [400
mg.] + H2O distillata [10 ml.]
sol. E :
“working”
Pararosanilina - HCl : sol. C
[0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.]
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
sezioni in H2O distillata
soluzione substrato : ( 0.8 ml.
sol. E+ 30 ml. sol. B; sistemare
il pH a 6.3 e aggiungere la sol.
A; mescolare e f iltrare)
1’
- 2’
lavare con H2O distillata
5’
Emallume acido di Mayer,
filtrato,
5’
lavare H2O di fonte
10’
soluzione satura Li2CO3 15”
lavare H2O di fonte
10’
disidratare in etanolo95°
4’
disidratare in etanolo 100° 4’
(3 cambi)
chiarificare in xilolo (3 cambi)
montare in resina sintetica
Risultati : l’attività enzimatica dell’ esterasi appare in
rosa - rosso; i nuclei in blu - scuro
SICUREZZA IN LABORATORIO
• CONSIDERARE OGNI CAMPIONE
POTENZIALMENTE INFETTO
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
BIOLOGICO
COME
SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI
USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE
USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE
AZOTO LIQUIDO
USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO
USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER
FORMALDEIDE E PER XILENE
USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE
USARE
MASSIMA
CAUTELA
NELL’ IMPIEGO DI
ULTRACENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED
APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE
EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E
TENERLO IL PIU’ PULITO POSSIBILE
CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I
SISTEMI DI ALLARME GAS E L’ ACCESSO ALLE VIE DI FUGA
OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI
NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN
LABORATORIO
RISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIO
•
RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER
AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA
LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI.
•
RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm)
e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI
ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....);
ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti :
ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......);
ESPOSIZIONE
VERSO
LA
DAB (benzidina derivato);
ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in
M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL
LATTICE.
•
RISCHIO
NUCLEARE
:
ESPOSIZIONE
VERSO
ISOTOPI
3
14
RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES ( H, C, 45Ca,
32P, 90Sr, 35S, 131I).
•
RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI
CUTANEE(nell’ uso del microtomo o nella dissezione in sala
anatomica); ESPLOSIONI
ED
INCENDI
ACCIDENTALI (nella
preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI
DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.
ARTEFATTI ISTOLOGICI
De fin izione
Dife tti o anomalie dei tessuti, da rife rire non ad un processo
naturale (fis iologico o patologico) m a all’in troduzione di
materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione,
inclusione, sezionamento, colorazione, m ontaggio dei vetrini.
E’ im portante riconoscere gli artefa tti, per evitare di
interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o
una m alattia del paziente.
ARTEFATTI ISTOLOGICI
1)Artefa tti causati prim a del prelievo:
1.1. Po lvere di talco
1.2. Ma teriale di sutura
1.3. Effe tto da term ocauterio
1.4. Effe tto da agenti chim ici
1.5. Pa rticelle di carbone
6
. Ga rza
1.7. Essicamento
ARTEFATTI ISTOLOGICI
2) Artefa tti causati nell’in tervallo tra il prelievo ed il
trattam ento istologico
2.1. Effe tti di schiacciam ento
2.2. Essiccazione
2.3. Conge lam ento
2.4. Ch inatura
2.5. In troduzione di m ateriali estranei quali grani di polvere
ARTEFATTI ISTOLOGICI
3) Artefa tti durante la fissazione
3.1. Au tolisi durante la fissazione
3.2. Fissazione inadeguata o incompleta
3.3. Effe tti da fissazione con Fiss. di Zenke r
(coartazione)
3.4. Deposito di cristalli di Sublim ato m ercurico
3.5. Effe tti di estrazione da fissazione in fo rm alina
3.6. Depositi di Em ateina acida da fiss. in fo rm alina
ARTEFATTI ISTOLOGICI
4)Artefa tti lega ti a procedure di inclusione
4.1. Inadeguata fissazione
4.2. Inadeguata disidratazione
4.3. Presenza di residui di liqu idi chiarificanti
4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina
4.5. Uso di paraffina troppo calda
ARTEFATTI ISTOLOGICI
5) Artefa tti lega ti alle procedure d’inclusione
5.1. Inclusione di frammenti m ultipli di
diversa durezza
5.2. Orientam ento scorretto dei frammenti
5.3. Pro lunga ta esposizione a paraffina sciolta
ARTEFATTI ISTOLOGICI
6
)Artefa tti da sezionamento erroneo
6
.1. An go lo di taglio sbagliato
6
.2. Lam a o blocchetto m al fissati
(e ffe tto “tende alla veneziana”)
6
.3. Lam e poco affilate
6
.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo
“pesci”
ARTEFATTI ISTOLOGICI
7
) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini
7
.1. Contam inazione dei vetri da m uffe o pollini
7
.2. Uso di quantità eccessive di adesivo
7
.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti
7
.4. Pie ghe nelle sezioni
7
.5. Bo lle d’a ria sotto le sezioni
7
.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni
ARTEFATTI ISTOLOGICI
8) Artefa tti da colorazione I
8.1. Mancata sparaffinatura
8.2. Effe tti di bolle tra sezione e vetro
8.3. Sbagli nella colorazione con:
8.4. Em atossilina di Ha rris
8.5. Em allum e di Ma ye r
8.6. Eosina
8.7. Im perfe tta disidratazione prim a del m ontaggio
ARTEFATTI ISTOLOGICI
8) Artefa tti da colorazione II
Sbagli nelle colorazioni speciali:
8.5. PAS
8.6. PAS-d iastasi
8.7. Rosso Congo
8.8. Giem sa
8.9. Feulgen
8.10. Me tenamina-a rgento per i fungh i
ARTEFATTI ISTOLOGICI
9
) Errori nel m ontaggio con copriogge tto
9
.1. Contam inazione del liqu ido di m ontaggio
9
.2. Uso di copriogge tto troppo piccoli
9
.3. Erroneo posizionamento del vetrino
9
.4. In trappolam ento di bolle d’a ria
9
.5. Montante troppo abbondante
9
.6. Montante troppo scarso
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.1.) Errori nella raccolta delle cellule
c.1.1. Ce llule sovrapposte
c.1.2. Ce llule troppo rade
c.1.3. Eccessiva quantità di sangue
c.1.4. Mancato uso di adesivo
c.1.5. Effe tto da citocentrifu ga
c.1.6. Contam inazione batterica (nelle urine)
c.1.7. “Stiram ento” delle cellule per compressione
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.2.) Errori nella fissazione delle cellule
c.2.1. Effe tti di essiccamento prim a della fissazione
(nella col. di Papanicolau)
c.2.2. Effe tti di essiccamento troppo lento
(nella col. di Giem sa)
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.3) Errori nella colorazione delle cellule
con la col. di Papanicolau
c.3.1. Co l. Nucleare troppo debole
c.3.2. Co l. Nucleare troppo intensa
c.3.3. Co l. con Orange G troppo debole
c.3.4. Co l. con Orange G troppo intensa
c.3.5. Co l. con Ve rde luce troppo debole
c.3.6. Co l. con Ve rde luce troppo intensa
ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.4) Errori nel m ontaggio con copriogge tto
c.4.1. Contam inazione del liqu ido di m ontaggio
c.4.2. Uso di copriogge tto troppo piccoli
c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino
c.4.4. In trappolam ento di bolle d’a ria
c.4.5. Montante troppo abbondante
c.4.6. Montante troppo scarso