schema del processo pilota - Food and Agriculture Organization of

(C2H5OH)
Development of biot echnology-based biofuels
Prof. Carlo V. Bruschi
Senior Scientist & Group Leader
Microbiology/Yeast Molecular Genetics group
ICGEB ĞAreas Science Park, Trieste
Seminar on The Role of Agricultural Biotechnologies for Production of Bioenergy in Developing Countries
FAO Headquarters, Iran Room
12 October 2007
"Broadly defined, biotechnology is the manipulation of
living organisms to produce goods and services useful to
human beings." (From: "Modifying Africa" of F. Wambugu).
Microbial agro-industrial biotechnology stems from the traditional
practices and products developed by farmers and their families for use on
the farm or in the homestead. These practices can be improved greately by
the correct implementation of genetic engineering
Ethical concerns: Modern biotechnology is often seen as unnatural, but in
fact it relies on most of the same spontaneous processes occuring in nature
and leading to improvement through selction
THE ICGEB, AT ITS LOCATION OF TRIESTE PROMOTES BASIC AND
ADVANCED SCIENTIFIC TRAINING IN THE AREA OF MICROBIAL
BIOTECHNOLOGY FOR ITS APPLICATIONS IN AGRO-INDUSTRY. AMONG
THE ICGEB MEMBER COUNTRIES SEVERAL AFRICAN COUNTRIES ARE
ALREADY TAKING ADVANTAGE OF THE ICGEB PROGRAMMES
(http://www.icgeb.org)
AREAS OF RESEARCH AND TRAINING UNDERGOING AT ICGEB:
Utilization of genetically selected yeast strains enriched for particular
aminoacids (lysine, methionine) for animal feed, and for cellulose and
hemicellulosa digestion. (Microbiology, Trieste)
Study of plant growth-promoting bacteria (Pseudomonads).
Development of insect and pesticide-resistant crops (N.D.)
Studies towards the production of stress (drought)-resistant plants (N.D.)
• Areas of Primary concern for
Developing Countries
• Epidemiology of food-related diseases and
genetic susceptibilities
• Impact of new technologies on food
production
• Chemical contaminants and pathogens
• Safer production and healthier foodstuffs
from agriculture
• Animal feed and impact on human health
• Environmental health risks
ROLE OF TECHNOLOGY PARKS AND INCUBATORS
IN TECHNOLOGY TRANSFER
Successful experiences in creating technology parks/ incubators
providing a basic infrastructure to transform ideas into products and
services can serve as model for developing Countries.
For example, given the comparative advantage of diversified
ethanol production in the world, particular emphasis could be
focussed upon research and transformation of agricultural products
in such technology parks.
It would also be advisable to set up technology parks near existing
institutions to attract foreign contract research funds to perform
applied research in situ.
Innovation for Development
Science
Innovation
Technology
Social
needs
Food Safety and Health Risks
Background and Aims:
• Assuring health and well-being of citizens
• Food intake and environmental factors
• Safer and health promoting foods
• Controlled and integrated production systems
• From farm to fork – consumer protection as the driver
• Epidemiology of food-related diseases and
genetic susceptibility
- Diet, lifestyle and health
- Measuring dietary intake and risk
assessment
- Influence of genetic variability
• Traceability
• Chemical contaminants and pathogens
- Analysis and detection
- Improved prevention and measurement control
- Prion detection, mapping, transfer mechanisms
• Safer production and healthier foodstuffs
- Conventional vs. organic vs. GMOs
- Improved animal welfare, husbandry and waste
management
• Animal feed and impact on human health
• Environmental health risks
Respiration (O2 + dispensable mitochondria, r+ , r-, r0) and
Fermentation (anaerobic) convert sugars (hexoses):
sucrose>fructose>glucose>maltose = CO2 + ethanol
THE ICGEB MANDATE
To provide a Centre of excellence for
research and training in genetic
engineering and biotechnology
addressed to developing countries
THE STRUCTURE
ICGEB IS ONE CENTRE, MADE OF TWO
COMPONENTS AND A NETWORK OF
AFFILIATED CENTRES
THE
ICGEB
TRIESTE COMPONENT
(ITALY)
NEW DELHI COMPONENT
(INDIA)
+
A NETWORK OF AFFILIATED CENTRES
ICGEB: an intergovernmental
organisation
67 Signatory States, 51 Member States, 2 Components: Trieste
(Italy) - New Delhi (India) and a network of 35 Affiliated Centres
NEW DELHI COMPONENT
INSTRUMENTS OF ACTION
•
•
•
•
•
•
•
RESEARCH PROJECTS
LONG TERM TRAINING
SHORT TERM TRAINING
COLLABORATIVE RESEARCH
PROGRAMME
COOPERATION WITH
INDUSTRIAL SECTOR
SCIENTIFIC SERVICES
INSTITUTIONAL SERVICES
SUMMARY OF THE ACTIVITY
OF THE ICGEB (1988-2004)
• INTERNATIONAL PUBLICATIONS: 1,220
• LONG TERM FELLOWSHIPS:
481 awarded;
797 MAN/YEARS
• SHORT TERM TRAINING:
5,826 persons trained
• RESEARCH GRANTS:
232 awarded
for a total of US$ 12,163,781.00
• PATENTS:
30 filed
• TECHNOLOGY TRANSFER
AGREEMENTS:
65 signed
INSTITUTIONAL ACTIVITIES
COOPERATION AGREEMENT WITH THE UNITED
NATIONS SECRETARIAT. UN AND ICGEB COOPERATE
IN ACTIVITIES RELATED TO
•
SAFE AND SUSTAINABLE USE OF GENETIC
ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY
•
PROTECTION OF BIODIVERSITY
•
BIOSAFETY AND RISK ASSESSMENT
•
IMPLEMENTATION OF ARTICLE X OF THE CONVENTION
ON BIOLOGICAL DISARMAMENT
MILLENIUM DEVELOPMENT
GOALS
“THE MILLENNIUM DEVELOPMENT GOALS MAY
BE MORE EASILY MET WITH THE EXTENSIVE
APPLICATION OF MODERN BIOTECHNOLOGY
IN AGRICULTURE AND HEALTH”
(Report of the Secretary-General on “Impact of new
biotechnologies, with particular attention to sustainable
development, including food security, health and economic
productivity”- 2003)
GENERAL ASSEMBLY
RESOLUTION 58/200 DECEMBER 2003
TAKES NOTE OF THE PROPOSAL OF THE
SECRETARY GENERAL FOR AN INTEGRATED
FRAMEWORK FOR BIOTECHNOLOGY
DEVELOPMENT WITHIN THE UN SYSTEM AND
THE NEED FOR STRENGTHENING COORDINATION BETWEEN THESE RELEVANT
ORGANISATIONS AND BODIES IN THE AREA OF
BIOTECHNOLOGY
INTER-AGENCY NETWORK FOR
CO-OPERATION IN BIOTECHNOLOGY
THE IANCB HAS BEEN ESTABLISHED IN MAY 2004 BY A
CLUSTER OF INTERNATIONAL ORGANISATIONS IN
ORDER TO:
• ELABORATE JOINT STUDIES
• STRENGTHEN THE ADVISORY ROLE IN BIOTECHNOLOGY
OF THE UN
• ASSESS THE IMPACT OF BIOTECHNOLOGY, IN
DEVELOPING COUNTRIES
• ESTABLISH A COMMON PORTAL FOCUSED ON BIOTECHRELATED ACTIVITIES LINKED TO THE EXISTING SCIENCE
AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT NETWORK
• ASSIST UNCTAD IN THE PREPARATION OF THE
REPORT TO THE UNITED NATIONS GENERAL
ASSEMBLY
UN - ICGEB
Co-operation Agreement
April, 2001
“THE UNITED NATIONS AND THE INTERNATIONAL
CENTRE FOR GENETIC ENGINEERING AND
BIOTECHNOLOGY …CO-OPERATE IN ACTIVITIES
RELATED TO THE SUSTAINABLE AND SAFE USE OF
GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY”
ACCORDINGLY, ICGEB IS PRESENTLY CHAIRING THE
INTER-AGENCY NETWORK FOR CO-OPERATION IN
BIOTECHNOLOGY AND IS TO PLAY A KEY ROLE IN
ASSISTING UNCSTD IN THE PREPARATION OF THE
REPORT TO THE GENERAL ASSEMBLY.
SCHEMA DEL PROCESSO PILOTA
ACCUMULO
MALIC
+Microbi ruminali
Omogeneizzazione meccanica
Vasca di idratazione
CRISCAT
Trasferimento calore al metano
Macinazione criogenica
Vasca con B. pumilus
Decanter per separazione lignina/cellulosa
Fermentazione per inoculo
Produzione di etanolo
Distillazione di etanolo
Modello di criomacinatore a scambio termico (CRISCAT)
BioEthos
Project plan : 3 FASI
Fase 1: Ricerca Scientifica - ICGEB
Ingegnerizzazione dei ceppi di lievito
1.1 produzione ceppi transgenici per digerire la cellulosa in collaborazione con la Piattaforma
Nazionale ITSusChem
1.2 ottimizzazione genomica per incrementare la percentuale di etanolo prodotto ad uso
industriale; l’ottimizzazione verra’ realizzata tramite l’impiego di tecniche di miglioramento
genomico in collaborazione con l’Universita’ di Oxford e grazie ad un sistema sviluppato e
brevettato dal laboratorio YMG dell’ICGEB
Fase 2: Sviluppo - AREA/Talent Srl/ICGEB
Fermentazioni pilota
2.1 Verifica in laboratorio di digestione della cellulosa da materiale criomacerato (ICGEB),
sviluppo di sistemi di controllo (Talent Srl)
2.2 sviluppo di impianto pilota con utilizzo di locali dell’AREA di ricerca per lo smaltimento di
rifiuti chimici; come ricaduta vi sara’ la creazione di un Centro di Fermentazione (AREA)
Fase 3: Implementazione industriale Cartiere Burgo/Endesa/GasNatural
Trasferimento di frigorie
3.1 Utilizzo del freddo prodotto dai rigassificatori (Endesa/GasNatural) per la
criomacerazione con conseguente digestione di cellulosa di scarto (Cartiere Burgo) e
produzione industriale di BioEtanolo. In questa fase e’ presente il coinvolgimento di
distributori petrolchimici.
Tempistica di attuazione del progetto
Fasi
Ricerca
ICGEB
ITSusChem
1.1 Nuovi lieviti
ICGEB
(Oxford)
1.2 Ottimizzazione
Talent/
ICGEB/
Reg. FVG?
Sviluppo
2.1 Verifiche
AREA/
Nuovi
Partners
2.2 Imp. Pilota
Burgo/
Endesa/
GasNatural/
Db.Petrolchimici
3.1 Trasferimento
frigorie
Produzione
(Implementazione
industriale)
0
1
2
3
t(anni)
DIAGRAMMA DI PROCESSO
FASE 1
Pre-trattamento interno
MALIC
cippato
Macinazione
meccanica
Batteri &
Lieviti
Macinazione
biogenica
PAD
Acido
Vanillico
Proposta di Progetto:
Produzione di bioetanolo con lieviti ingegnerizzati,
via fermentazione di derivati vegetali criomacerati
nella regione Friuli Venezia-Giulia
Responsabile: Prof. Carlo V. Bruschi
Head, Yeast Molecular Genetics Group ICGEB
AREA Science Park, Trieste
Department of Genetics and Developmental Biology
University of Salzburg, Austria
Collaboratori:
Dr. Sergio Stibelli
Talent S.r.l, Trieste
Paolo Mander
Sister - Liaison Office
AREA Science Park, Trieste
Il sistema BIT per la bioenergia
La linea pilota sarˆ basata sulle apparecchiature per la macinazione criogenica, la
separazione della lignina, il s istema di fermentazione per la preparazione dellÕ
inoculo, la produzione e distillazione dellÕ etanolo.
Il processo che si sperimenterˆ sarˆ del tipo SSCF ( Simultaneous
Saccharification and Co- Fermentation) con la variante di: i) non avere enzimi in
soluzione, ii) avere un unico agente microbico, il lie vito S. cerevisiae
ingegnerizzato con enzimi cellulasi ed emicellulasi espressi sulla superficie
cellulare e iii) in grado di trasformare zuccheri in una pi alta percentuale di alcol.
Questo processo innovativo, derivante dallÕevoluzione del precedente SSCF, verrˆ
indicato con la nuova sigla CEDY (Cellulose to Ethanol Directly by Yeast).
La fermentazione 
u n processo complesso ma noto nelle sue variabili e
caratteristiche mentre pinecessaria la comprensione dei meccanismi di adesione e
catalisi degli enzimi endo- ed eso-glucanasi, cellobioidrolasi ed i corrispondenti per lÕ
emicellulosa, ai siti di legame e di catalisi sulla cellulosa ed emic ellulosa . Questa
dinamica regola i tempi e lÕefficacia del processo. Il glucosio e lo xilosio saranno
metabolizzati dal lievito nello stesso momento della sua produzione per cui mancherˆ
lÕ nibizione
i
da metaboliti. La concentrazione del lievito aumenterˆ fino a livelli
stazionari in cui sarˆ rim osso dal bioreattore per mantenere il processo nella fase
esponenziale. Il tasso alcolico massimo attuale del 13 %, nella fase di ingegneria
genetica si cercherˆ di portarlo al 20 Ğ 26% con un notevole guadagno economico nel
processo.
3.4
Ingegnerizzazione genetica del lievito
3.4.1 Identificazione dei geni eterologhi degli enzimi necessari
Il lievito Saccharomyces cerevisiae, oggi universalmente riconosciuto come
il piimportante microrganismo per le biotecnologie, e di grado GRAS (Generally
Recognized As Safe), non possiede la capacitˆ enzimatica per metabolizzare la
cellulosa, ma bens“ estremamente efficiente nella produzione di etanolo partendo
da zuccheri semplici quali il glucosio. Di c onseguenza, occorre introdurre nel
lievito i g eni codificanti per gli enzimi che degradano la s truttura fibrillare della
celulosa fino a ridurla a l ivello del monosaccaride glucosio che la cellula pu˜
assimilare. Di tali geni esistono diversi esempi, alcuni dei quali giˆ studiati ed
isolati da laboratori di r icerca, in particolare in Giappone e Finlandia. Verranno
quindi isolati i geni codificanti per i seguenti enzimi:
i)
endoglucanasi II ( EGII) dal fungo Trichoderma reesei, ceppo QM9414, in
grado di digerire le
catene di cellulosa in modo casuale;
ii)
cellobioidrolasi II (C BHII) dal fungo Trichoderma reesei, ceppo QM9414,
in grado di staccare
cellobiosio, cio molecole dimeriche di gl ucosio
dallÕestremitˆ della catena di cellulosa;
iii ) §-glucosidasi I (BGL1) dal fungo Aspergillus aculeatus, ceppo F50, in grado
di scindere una
molecola dimerica di cellobiosio in due molecole di glucosio.
Come miglio ramento innovativo dellÕattuale stato dellÕarte, i ceppi
transgenici di l ievito cos“ costruiti verranno sottoposti ad u n nuovo sistema di
mutagenesi globale per traslocazione cromosomica. In pratica, il ba ckground
genetico di questi ceppi verrˆ riarrangiato casualmente su l arga scala sfruttando
una rivoluzionaria tecnologia genetica messa a p unto nei laboratori dellÕICGEB
dellÕAREA di Ricerca di Trieste.
3.4.5 Ottimizzazione / Fermentazione
La ricerca di condizioni ottimali per la produzione di etanolo verrˆ effettuata
sia su piastra, misurando la diminuzione della fluorescenza emessa dalla cellulosa
presente. Successivamente i ceppi che daranno i valori pi alti saranno oggetto di
mutagenesi globale tramite induzione di traslocazioni cromosomiche per mezzo del
sistema BIT (Bridge-Induced Translocation). La selezione avverrˆ per rivelazione
automatica di concentrazione di etanolo per mezzo di appositi sensori enzimatici. I
ceppi selezionati verranno testati in mini-fermentatori con diverse composizioni di
MALIC ed eventualmente riassoggettati a ulteriori cicli di mutagenesi globale fino
a dare risultati soddisfacenti, da testare su scale pilota.
Per ultimo, utilizzando le recentissime scoperte del gruppo di Gerald Fink
negli USA, sul Òquorum sensingÓ del lie vito, si utilizzeranno le due molecolesegnale individuate, il feniletanolo e triptofolo, per aumentare la densitˆ massima
delle cellule in terreno liquido nonch il g rado alcolico prodotto dai ceppi
transgenici.
3.1.1.1 Struttura chimica della lignina
La lignina u n polim ero amorfo, eterogeneo e c himicamente complesso.
LÕeterogeneitaÔ della lignina  dovuta al suo elevato peso molecolare derivante
dallÕunione di differenti acidi ed alcoli fenilpropilici (cumarilico, coniferilico e
sinapilico). LÕaccoppiamento casuale di questi alcoli dˆ luogo alla struttura
tridimensionale complessa della lignina.
Nelle figure seguenti sono riportate le
strutture chimiche degli alcooli (A) e acidi cinnamici (B), noncheÔ la formula
strutturale della lignina (C) proposta da Adler.
A
2
R
2
1
R =R =H
CH
CH
1
CH OH
2
alcool p-cumarilico
1
2
R = OCH , R = H
3
alcool coniferilico
R = R = OCH
alcool sinapilico
1
2
3
R
B
2
R
1
2
R =R =H
OH
CH
1
R
CH
COOH
1
R = OCH , R 2= H
3
1
2
=
R R = OCH
3
acido p-cumarico
acido ferulico
acido sinapico
C