Sintesi di N-idrossi pirrolidina

Classificazioni degli Enzimi
1
IDROLASI

Sintesi del (S)-Ibuprofen
Derivati di acidi -arilpropionici rapresentano una delle
piu' importanti classi di farmaci antiinfiammatori e
antidolorifici non steroidei. Tra i piu' noti l' Ibuprofen
venduto in tutto il mondo in grande quantita'. Questa
molecola e' chirale ed e' dimostrato che l' enatiomero (S) e'
responsabile della attivita' terapeutica.
Ciononostante
l'ibuprofen
viene
normalmente
somministrato come racemo, sebbene sia stato dimostrato
che l' enantiomero R si accumula nei grassi come estere del
glicerolo, i cui effetti a lungo termine non sono noti. E'
importante quindi sviluppare strategie sintetiche per
ottenere solo l’ enantiomero (S).
(J. Org. Chem. 64, 5029 (1999))
IDROLASI
OH
Br
OH
+ HBr
R
Br
OH
via SN1 R
O
O
+ OHR
R
Glicosidasi o glicoside idrolasi
La glicosidasi è una famiglia di enzimi deputata alla
catalisi dell'idrolisi di un legame glicosidico per
scindere un glicoside originando due glicosidi più
semplici.
Sono enzimi estremamente comuni in natura che
presentano differenti ruoli, quali la degradazione
delle biomasse, come cellulosa ed emicellulosa, nei
lisozimi per la difesa da aggressione batterica, come
anche nei meccanismi di patogenetici dei virus,
mediati dalle neuraminidasi.
Glicosidasi
L’ approccio chimico che utilizza lattosio ed acido
sialico richiede 14 passaggi con una resa totale del
5%: nel passaggio di sialilazione si osserva una
scarsa selettivita’  che impone una difficile
separazione degli anomeri che vengono recuperati
con basse rese. L' approccio chemoenzimatico,
utilizzando un ceppo ricombinante contenente la
trans- sialidasi di Trypanosoma cruzi
per
effettuare il passaggio di sialilazione, richiede
dieci passaggi, con una resa totale del 10%.
Inoltre l’ approccio chemoenzimatico richiede solo
3 purificazioni cromatografiche, l’ approccio
chimico ne richiede almeno 9.
REAZIONI DI IDROSSILAZIONE ENZIMATICA
L’ idrossilazione, la trasformazione di un legame C-H in un legame C-OH, è una delle attività enzimatiche
più diffuse, presente in tutte le forme di vita, dai batteri agli umani. La reazione fa parte del metabolismo
ossidativo di molti composti, sia composti farmaceutici utili che inquinanti ambientali dannosi. E’ usata da
molti anni sia nella produzione industriale di “fine chemicals” che in processi di biorisanamento.
Nonostante la sua diffusione, è una delle reazioni enzimatiche meno comprese perché molte idrossilasi sono
complessi multiproteici legati alla membrana cellulare, difficili da isolare e spesso instabili una volta isolati.
Dal momento che i materiali di partenza in sintesi organica sono spesso, in ultima analisi, alcani, alcheni e
derivati aromatici provenienti dal petrolio, l' introduzione di gruppi funzionali richiede principalmente una
trasformazione chiave: una ossidazione. Dal momento che la ossofunzionalizzazione diretta di un legame CH non attivato è impraticabile, la tecnologia chimica tradizionale è legata alla alogenazione (radicalica), con
conseguenti problemi ambientali.
L' idrossilazione microbica è pressoché l' unica possibilità per introdurre un gruppo ossidrilico in un sito CH non attivato in modo regio- e stereo-selettivo e nel rispetto dell' ambiente . Questo avviene a spese del più
economico e innocuo ossidante sulla terra, l' ossigeno molecolare. Sfortunatamente queste monoossigenasi
dipendono strettamente da un cofattore redox, spesso NADPH. Questo comporta l' uso di un sistema di
cellule intere per evitare il problema del riciclo del cofattore esterno.
Tenendo presente i problemi legati all' uso dell' ossigeno molecolare, suoi derivati (es. perossido di idrogeno o
alchil perossidi) possono essere usati come ossidanti per le perossidasi.
Diversamente dalle monoossigenasi, le perossidasi sono infatti indipendenti da cofattori e possono essere
quindi usate in forma isolata (o parzialmente pura), rendendo così il sistema più semplice da utilizzare
rispetto alle trasformazioni con cellule intere. Di conseguenza enzimi (principalmente derivanti da piante e
funghi) capaci di dare reazioni di perossidazione sono stati studiati con crescente interesse negli ultimi anni
per catalizzare reazioni di idrossilazione, epossidazione, ossidazione allo zolfo.
Applicazioni sintetiche
• Produzione di alcoli sinteticamente utili
Diversi microrganismi sono in grado di idrossilare
il trimegestrone, un progestinico: le frecce
indicano i vari siti di idrossilazione. I derivati 1 e
6-idrossilati sono identici a metaboliti del
trimegestrone, mentre gli altri derivati idrossilati
sono nuovi prodotti di potenziale interesse
farmacologico.
Aspergillus e Penicillium sp.
Un mutante di quest’ ultimo, prodotto per irraggiamento UV ha
mostrato un aumento significativo di attivita’ rispetto al
selvatico, nella sintesi del verbenolo, un composto dall’ aroma
di menta.
L’ idrossilazione enzimatica e’ di grande interesse
nella sintesi di composti chirali. Un esempio e’ la
sintesi della (S)-N-benzil-3-idrossi-pirrolidina
realizzata usando un ceppo ricombinante di E. coli
contenente il gene codificante la idrossilasi da
Pseudomonas oleovorans. La (S)-N-benzil-3idrossipirrolidina e’ un intermedio nella preparazione
di calcio antagonisti
(Current Opinion in Biotec. 11, 547 (2000))
 Biodegradazione di inquinanti e Studi di tossicita’
La reazione di idrossilazione e’ comunemente osservata nella degradazione di inquinanti ambientali e lo studio di questa
reazione e’ di interesse anche per studiare la tossicita’ di questi composti per gli umani. L’ espressione del citocromo P450
umano in colture cellulari di un tipo di criceto ha permesso lo studio del metabolismo degli idrocarburi policiclici aromatici
(PAHs) quali l’ 1-metilpirene, dove la degradazione avviene tramite idrossilazione della posizione benzilica.
Un processo strettamente correlato, la conversione di idrocarburi a lunga catena, inizia con una reazione di
idrossilazione, come mostrato usando Candida tropicalis.
Questo metodo descritto per ottimizzare la reazione di idrossilazione rappresenta un avanzamento significativo, dal
momento che esamina sistematicamente tutti gli aspetti del processo a livello enzimatico.Questo include la espressione
degli enzimi responsabili della idrossilazione, l' espressione delle proteine di trasporto elettronico associate e la
eliminazione delle reazioni collaterali.
 Idrossilazione aromatica. Produzione di catecoli
L’ enzima CYP1B1 appartiene alla famiglia del citocromo P450 ed e’ sovra espresso in una serie di tumori (cervello, seno,
colon, polmoni), ma non si trova in tessuti normali. Sebbene il ruolo funzionale di questo enzima non sia chiaro, e' noto che e'
in grado di idrossilare sistemi aromatici, catalizza ad esempio la conversione dell' estradiolo a 4-idrossi estradiolo.
Il resveratrolo e’ un prodotto naturale che si trova nel vino ed al quale sono state attribuite varie proprieta', ad esempio una
attivita' chemopreventiva.
Il piceatannolo ha una struttura strettamente correlata a quella del resveratrolo ed ha mostrato attivita’ antileucemica. La
attivita' del resveratrolo (che agirebbe in questo come "prodrug" naturale) potrebbe essere dovuta alla bioattivazione da parte
dell' enzima.
Manipolazione enzimatica
La manipolazione delle condizioni in cui operano gli enzimi, eventualmente insieme alla manipolazione genetica degli stessi, puo’
portare a specifiche attivita’ enzimatiche non ottenibili altrimenti. Un esempio e’ fornito dal controllo delle concentrazioni di ossigeno
disciolto per modulare la regioselettivita’ dell’ ossidazione dell’ acido cis-pentadecen-10-oico con cellule di E. coli contenente la
idrossilasi citocromo P450-BM3 da Bacillus megaterium. In condizioni limitanti di ossigeno, si ottengono solo i prodotti di monoidrossilazione derivanti dalla idrossilazione nelle posizioni -1, -2 e -3 (indicate dalle frecce). Con ossigeno in eccesso si ottengono
altri prodotti derivanti dall’ attacco al doppio legame olefinico.
La manipolazione delle idrossilasi per facilitare attivita’ differenti
e’ illustrata dal citocromo P450cam, un enzima che normalmente
catalizza la idrossilazione ossigeno-dipendente della canfora, ad
un mutante che catalizza la idrossilazione del naftalene usando
perossido di idrogeno come ossidante. Il valore di questa
modificazione non deriva solo dalla sostituzione della specie
ossidante, ma soprattutto dal fatto che questa variazione elimina
anche la necessita’ di proteine deputate al trasporto di elettroni e
cofattori quando la idrossilasi viene usata in forma isolata.
La idrossilazione del clorotoluene in posizione benzilica e’
il primo passaggio nella biodegradazione di questo
inquinante. E’ stata costruita una molecola di DNA che
codifica sia per una idrossilasi di origine batterica
(citocromo P450cam) che una idrossilasi da mammifero
(citocromo P450 2C9). L’ espressione di questo DNA in un
microrganismo ospite risulta in una fusione degli enzimi
che combina la natura solubile dell’ enzima batterico con
l’ ampia specificita’ di substrato dell’ enzima da
mammifero. Si ottiene cosi’ un biocatalizzatore con una
attivita’ tre volte superiore a quella dell’ enzima batterico
da solo.
Altri esempi
Ossidazioni selettive catalizzate da perossidasi
Una delle maggiori sfide nella biocatalisi e' lo sfruttamento dell' enorme potenziale delle monoossigenasi, quali la
monoossigenasi dell' ubiquitario citocroma P450.
In vivo questi enzimi catalizzano l' inserzione di un atomo di ossigeno in una ampia varieta' di substrati, spesso con un
alto grado di chemo-, regio- e stereoselettivita'. L' esempio piu' studiato e' la ossidazione regio- e stereoselettiva della
canfora mediata dal citocromo P450cam.
Sfortunatamente queste monoossigenasi richiedono un cofattore e di conseguenza un sistema complesso di rigenerazione
del cofattore (NAD(P)H) che limita fortemente il loro uso industriale.
Inoltre sono relativamente instabili e difficili da purificare. Per questi motivi sono spesso usate non come enzimi isolati
ma come sistemi di cellule intere che, tuttavia, possono dare reazioni collaterali che abbassano la enatioselettivita' e la
resa chimica della reazione.
Stato della ricerca: creare mutanti dei P450s che usino perossido di idrogeno come ossidante.
Le perossidasi, che naturalmente usano perossido di idrogeno come ossidante, sono pure ubiquitarie.
Alcune perossidasi, come la ascorbato perossidasi, agiscono da "spazzino" per il perossido di idrogeno. Altre catalizzano
la oligomerizzazione e la polimerizzazione radicalica di composti aromatici elettron-ricchi. La perossidasi della lignina
catalizza la degradazione ossidativa della lignina. Le alogeno perossidasi (che possono alogenare substrati organici)
rivestono probabilmente un importante ruolo nel sistema di difesa degli organismi.
Le perossidasi sono strutturalmente e funzionalmente correlate alle monoossigenasi ma, a differenza delle
monoossigenasi, non richiedono un cofattore costoso.
Inoltre diverse perossidasi sono enzimi extracellulari relativamente stabili che possono accettare una varieta' di substrati
in diverse reazioni.
La cloroperossidasi da Caldariomyces fumago (CPO) e' il biocatalizzatore di scelta per applicazioni sintetiche, ad es. per
reazioni di idrossilazione, epossidazione.
CPO e' facilmente ottenuta in grandi quantita' dal mezzo colturale ed e' facile da purificare.
Le reazioni di ossidazione procedono a completamento purche' vi sia sufficiente ossidante presente e il catalizzatore
rimanga attivo. Quest' ultima condizione non e' sempre soddisfatta; di conseguenza i numeri di turnover del catalizzatore
(TTN: mole di prodotto formato per mole di enzima usato) non e' sempre soddisfacente.
La famiglia degli enzimi P450 ha un ampio repertorio di reazioni di idrossilazione, mentre le perossidasi sono molto
piu’ limitate in questo senso. Solo CPO media l’ idrossilazione di un certo numero di legami C-H attivati. Alcuni esempi
sono sotto riportati
DIOSSIGENASI "AROMATICHE" E BIOTECNOLOGIA AMBIENTALE
• Il ruolo delle mono- e di-ossigenasi nel metabolismo degli areni.
Si assume che due siano i meccanismi fondamentali del metabolismo degli anelli aromatici nei sistemi viventi:
- ossidazione a fenolo, catalizzata da una monoossigenasi, via formazione di un epossido
intermedio (cammino A) ( generalmente negli animali, nelle piante e nei funghi (eucarioti));
-ossidazione catalizzata da una diossigenasi a dare cis-diidrodioli vicinali, attraverso un processo
di diossidrilazione asimmetrica (cammino B) (sistemi batterici (procarioti)).
Nel cammino A l' intervento di una epossido idrolasi puo' convertire l' epossido iniziale in un trans-diidrodiolo.
La formazione dei cis-diidrodioli, catalizzata dalla diossigenasi, e la formazione dei trans-diidrodioli,
catalizzata dalla monoossigenasi seguita dalla epossido-idrolasi, sono distinguibili in base all' origine degli
atomi di ossigeno.
Entrambi gli ossigeni in un cis-diidrodiolo derivano dalla molecola di ossigeno atmosferico, mentre in un
trans-diidrodiolo un ossigeno deriva da O2 e l' altro dall' acqua.
Natural Products Reports, 15, 309 (1998)
• Diossigenasi
Le diossigenasi catalizzano reazioni di ossidazione nelle quali entrambi gli atomi di ossigeno vengono incorporati nel
bioprodotto. La definizione e’ applicabile alle (a) lipoosigenasi (idroperossidazione dei polieni), (b) alle ossigenasi che
catalizzano la rottura dell’ anello aromatico (fissione del legame C-C dei catecoli) e (c) alle diossigenasi che catalizzano l'
addizione di O2 al nucleo aromatico fornendo cis-dioli.
Due sono le ragioni principali che spiegano l' interesse per questi enzimi.
In primo luogo gli idrocarburi aromatici sono inquinanti comuni del suolo e delle acque e la loro rimozione da parte dei
microrganismi rappresenta una potenziale soluzione ai problemi ambientali legati a questi inquinanti. La diidrossilazione dell'
anello aromatico e' il prerequisito per l' ossidazione del nucleo aromatico da parte delle diossigenasi batteriche di tipo (b). Gli
idrocarburi aromatici contengono solo atomi di carbonio e di idrogeno. Lo studio delle diossigenasi che ossidano gli
idrocarburi aromatici a cis-dioli e' quindi di notevole importanza per lo sviluppo di tecnologie di biorisanamento.
Il secondo motivo di interesse e' collegato alla ricerca di metodologie ambientalmente compatibili per la produzione di
composti chimici industrialmente utili. In questo senso le diossigenasi soddisfano i requisiti della "chimica verde" producendo
nuovi cis-dioli arenici enantiopuri, non ottenibili con metodi convenzionali. I dioli sono usati come sintoni chirali nello sviluppo
di nuovi composti di interesse industriale e medico. Due esempi sono il polifenilene e la prostaglandina E2
1
Il cis-cicloesadiendiolo 1 (1968) e' il primo
esempio di cis diolo stabile derivante da
ossidazione batterica di un idrocarburo aromatico.
L'equivalente chimico di questa trasformazione fu
riportato molti anni dopo nella sintesi del
conduritolo E racemo.
Sono stati oggi identificati piu' di 300 cis-dioli
arenici ottenuti per ossidazione batterica di
idrocarburi aromatici strutturalmente diversi, dal
toluene al benzopirene. In quasi tutti i casi i
bioprodotti sono stati ottenuti come singoli
enantiomeri.
Le diossigenasi responsabili della formazione dei
cis-dioli, prevalenti negli organismi procarioti,
possiedono generalmente sistemi enzimatici
multicomponenti comprendenti diverse proteine,
un ferro di tipo non-eme e richiedono NADH.
Gli organismi contenenti diossigenasi sono stati cresciuti su diverse fonti di carbonio e gli enzimi sono stati classificati di
conseguenza: es. benzene-diossigenasi (BDO), naftalene- (NDO), toluene- (TDO), benzoato- (BZDO) e bifenile-diossigenasi
(BPDO).
Gli studi iniziali di biotrasformazione di composti aromatici sono stati condotti utilizzando batteri Gram-negativi (es.
Pseudomonas e Sphingomonas). Piu' recentemente NDO, TDO e BZDO sono state trovate anche in batteri Gram-positivi
(es.Rhodococcus).
La NDO, la cui struttura e' stata riportata nel 1998, assomiglia al citocromo P450 nella sua capacita' di catalizzare reazioni
quali: monoidrossilazione, deidrogenazione, O- e N-dealchilazioni. P450, tuttavia, non e' in grado di catalizzare la cisidrossilazione enantiospefica degli areni e NDO non ossida gli alcheni ad epossidi.
Usando ceppi batterici selvatici, mutanti o ricombinanti o le diossigenasi purificate, si puo' avere una vasta gamma di
reazioni di ossidazione. Sono state osservate mono-idrossilazioni ai gruppi metilici e metilenici attivati da gruppi fenilici
adiacenti (idrossilazione benzilica) o vinilici (idrossilazione allilica) o carbonilici (formazione di cheto alcoli). La
diidrossilazione puo' derivare da due successive monoidrossilazioni a due centri benzilici o da un attacco concomitante di
un alchene o di un arene da parte dell' ossigeno molecolare.
Due tipi di batteri vengono generalmente usati per ossidare i composti aromatici a cis-dioli: mutanti del ceppo selvatico che
hanno perso la capacita' di deidrogenare i cis-dioli; ceppi ricombinanti di E.coli contenenti i geni della diossigenasi.
E' importante specificare il particolare mutante usato che
puo' fornire tipi diversi di diossigenasi e quindi diversi
bioprodotti. Ad esempio alcuni mutanti di P. putida sono
fonte di TDO, altri mutanti di BZDOs e NDO. Mutanti di
una specie di Beijerinckia, recentemente classificati come
S. yanoikuyae e Alcaligenes eutrophus contengono BPDO e
BZDO rispettivamente.
I geni codificanti i componenti di TDO e di NDO in
mutanti selezionati di P. putida sono stati successivamente
clonati ed espressi in Escherichia coli.
Come scegliere il tipo di diossigenasi piu' appropriato per una determinata trasformazione?
In generale TDO e' piu' adatta alla cis-diidrossilazione di benzeni sostituiti e areni biciclici; NDO e' particolarmente utile per areni
bi- e tri-ciclici; BPDO e' piu' appropriato per composti aromatici policiclici grandi (3-5 membri) e BZDO per acidi benzoici.
Effetto della struttura della diossigenasi sulla regio- e stereoselettivita' nella cis-diidrossilazioni degli areni.
Le specificita' enantiomeriche delle singole diossigenasi sono uniche e in alcuni casi
complementari: entrambi gli enantiomeri possono essere ottenuti usando diossigenasi diverse.
Es.1 L' uso combinato di TDO (a dare il cis-diolo 83S), carbazolo diossigenasi (a dare il cis-diolo 83R), NDOF352 (a dare il cisdiolo 93R), e NDOwt (a dare il cis-diolo 93S) fornisce i quattro cis-dioli isomeri dal bifenile (R = Ph).
Es. 2 La naftalene diossigenasi e la toluene diossigenasi ossidano l' indene ed idrocarbudri analoghi a cis-dioli con
opposta enantioselettivita'
Regioselettivita' e
configurazione assoluta
preferite nei cis-dididrodioli da
benzeni mono- e disostituiti
Il controllo della regioselettivita’nella cis-diidrossilazione di idrocarburi aromatici policiclici (PAHs) dipende largamente dalla
forma del substrato e avviene sempre nelle regioni “baia” o “fiordo”
Applicazioni di interesse industriale
Polifenilene
Il poli(p-fenilene) e' un composto di interesse per la sua stabilita' termica e possibilita', in opportune condizioni, di condurre la corrente.
Tuttavia, essendo infusibile e insolubile in solventi organici, i suoi usi sono limitati. Uno dei metodi usati per la sua produzione,
rappresentato nell' eq. 1, fornisce solo oligomeri. Inoltre e' difficile preparare fibre e film con questa tecnologia.
Sono stati saggiati vari metodi di preparazione che non coinvolgano policondensazione, ad es. polimerizzazione del cicloesadiene (eq. 2).
Ma le drastiche condizioni di aromatizzazione richieste provocano la rottura della catena.
Al contrario opportuni derivati del cis-diolo 6, ottenuto da benzene e ossigeno usando uno P. putida geneticamente modificato come
catalizzatore di ossidazione, polimerizzano facilmente a polimeri di alto peso molecolare 5, molto solubili nei solventi organici. Queste
soluzioni possono essere usate per ottenere film e fibre.
In questa forma infatti, per riscaldamento a 140-240 gradi, si ha una facile conversione in polifenilene.
Indinavir
Crixivan (Indinavir) e' un inibitore, oralmente attivo,
della proteasi dell' HIV. Possiede cinque centri di
chiralita': un suo intermedio di sintesi e' il cis (1S, 2R)1-aminoindan-2-olo. Questo composto puo' essere
direttamente sintetizzato dal cis-(1S, 2R)diidrossiindano. La toluene diossigenasi ossida l' indene
producendo l' enantiomero desiderato. Tuttavia l'
eccesso enantiomerico e' basso (30%). Un ceppo
ricombinante di E. coli che esprime sia la TDO che la
diidrodiolo diossigenasi ha portato alla produzione del
cis-(1S, 2R)-diidrossiindano enantiomericamente puro
(ee > 99%).
Inositoli
Prostaglandina
2-Amminotetraline
La 8-idrossi-2-(dipropilammino)tetralina (8-OH-DPAT) e' un potente ed
efficace agonista del recettore della 5-idrossitriptamina, una proprieta' utile
per il trattamento dell' ansieta' e della depressione.
E' stato messo a punto un protocollo chemoenzimatico per la sintesi di un
precursore della 8-OH-DPAT utilizzando un ceppo ricombinante di E. coli
contenente il gene della naftalene diossigenasi
Formazione stereoselettiva del legame C-C in acqua
I metodi convenzionali per la formazione del legame C-C richiedono l’ uso di solventi organici anidri
perche’ (salvo poche eccezioni) le speci carbanioniche “donatrici” sono incompatibili con il mezzo acquoso. Di
conseguenza , ogni gruppo funzionale che possegga idrogeni acidi deve essere opportunamente mascherato per
evitare reazioni collaterali indesiderate, il che comporta una serie di reazioni di protezione/successiva deprotezione
(conseguente diminuzione della resa finale del prodotto, aumento dei materiali di scarto).
In questo contesto , i processi biocatalitici sono di grande interesse dal momento che catalizzano la formazione del
legame C-C in acqua, evitando cosi’ l’ uso di gruppi protettivi e facilitando enormemente la costruzione dello
scheletro di atomi di carbonio.
La formazione catalitica del legame C-C e’ uno tra i metodi sintetici piu’ utili in sintesi asimmetrica.
Aldolasi e transchetolasi sono biocatalizzatori versatili e sinteticamente utili per questo tipo di trasformazione.
Le aldolasi sono state ampiamente usate nella sintesi di carboidrati e loro mimetici. Ad esempio sono
state usate per catalizzare la condensazione tra diidrossi acetone fosfato (DHAP) e una vasta gamma di -idrossi
aldeidi per la preparazione di mimetici quali tio-zuccheri (zuccheri nei quali l’ atomo di ossigeno in anello e’ stato
sostituito con uno zolfo) e aza-zuccheri (zuccheri nei quali l’ atomo di ossigeno in anello e’ stata sostiuito con un
azoto).
Le aldolasi sono anche utili nella preparazione di unita’ strutturali presenti in prodotti naturali complessi quali idrossi--amminoacidi.
Le transchetolasi sono state usate nella sintesi di aromi e fragranze, ad esempio nella preparazione del
6-desossi-L-sorbosio, del 4-desossi-D-fruttosio 6 fosfato.
Le transchetolasi sono state sovraespresse e sono ora disponibili in grande quantita’ per lo sviluppo di processi su
grande scala.
Decarbossilasi in sintesi asimmetrica
Le reazioni di decarbossilazioni condotte usando enzimi o microorganismi interi sono sempre piu’ usate nella
sintesi di composti enantiomericamente puri per il loro alto grado di regio- e stereospecificita’.
Enzimi quali la piruvato decarbossilasi sono in grado di catalizzare due tipi di reazioni: la decarbossilazione non
ossidativa di -cheto acidi alle corrispondenti aldeidi ed una reazione di condensazione a dare -idrossichetoni,
intermedi utili e versatili per la produzione di composti dell’ industria chimica e farmaceutica.
In questo ambito, uno dei primi processi di biotrasformazione realizzati su scala industriale, utilizzando cellule
intere di lieviti, e’ stata la sintesi del L-fenil-acetil carbinolo (L-PAC), un precursore della L-efedrina e di
pseudoefedrine ad essa correlate.
Parecchie decarbossilasi derivanti da lieviti e da batteri sono state successivamente usate per la sintesi di: idrossichetoni, acidi -aril acetici, D-ammino acidi, dopamina, acidi organici.
 Reazioni di condensazione: formazione di un centro di chiralita’.
 Reazioni di decarbossilazione con formazione di un centro di chiralita’
O
H
Phenylpiruvate decarboxylase
+
OH
CH3CHO
OH
O
O
CO2
Meccanismo
O
O
O
H
O
O
O
C
O
+
O
H
O
 Reazioni di decarbossilazione con modificazione dei sostituenti su un centro di chiralita’
Meccanismo
OH
O
O
H
C
O
O
OH
O
+
OH
O
H+
O
H
Saccharomice cerevisiae e' stato utilizzato per produrre una serie di L-acetilcarbinoli aromatici. Il processo
fermentativo e' limitato da reazioni collaterali a causa dei diversi enzimi presenti nelle cellule e della instabilita'
delle cellule in presenza di benzaldeide. Si puo' aumentare l' efficienza nella produzione di -idrossichetoni
controllando la concentrazione dei cofattori: TPP e Mg2+ durante la trasformazione della aldeide. La tossicita'
della benzaldeide puo' essere limitata mediante:
- progressiva aggiunta del substrato;
-scelta di un ceppo opportunamente selezionato;
-uso di cellule immobilizzate;
-uso di un un mezzo contenente un solvente organico per diminuire la concentrazione del substrato
in fase acquosa e ridurre il suo impatto tossico sui batteri.
APPLICAZIONE DI TRANSCHETOLASI IN SINTESI ORGANICA
Formazione del legame C-C
L' enzima transchetolasi (TK) occupa posizione centrale nella regolazione del metabolismo. Ha un ruolo di controllo nel
fornire unita' di ribosio nella biosintesi dei nucleosidi e, nei microrganismi, fornire eritrosio 4-fosfato nella biosintesi degli
amminoacidi.
Identificato per la prima volta nel Saccharomyces cerevisiae, successivamente localizzato in altre fonti , inclusi gli spinaci.
I geni degli enzimi di S.cerevisiae e di Escherichia coli sono stati sovraespressi, rendendo disponibili grandi quantita' di enzima
per studi biofisici e applicazioni in sintesi organica
In vivo l' enzima catalizza il trasferimento reversibile di una unita' C-2 (chetolo) dal D-xilulosio 5-fosfato al D-ribosio 5fosfato.
La reazione puo' essere piu' generalmente utile usando acido idrossipiruvico (HPA), come donatore di unita' C-2: l' uso
di HPA rende infatti la reazione irreversibile per effetto della formazione di CO2 come sottoprodotto. L' attivita di TK
dipende da metallo cationi divalenti (generalmente Mg++) e tiamina pirofosfato (TPP)

Sintesi del 6-desossi-L-sorbosio
TK da spinaci e’ stato utilizzato in una sintesi chemoenzimatica del 6-desossi-L-sorbosio, un
noto precursore del furaneolo, un composto con il sapore di caramella. In questa sintesi anche
l’ idrossipiruvato e’ stato preparato per via enzimatica. Il 4-desossi-L-treosio e’ stato ottenuto
per isomerizzazione del 4-deosossiL-eritrulosio usando cellule intere di Corynebacterium equi o
Serratia liquefaciens.
(Tetrahedron 1996, 52, 8223)

Sintesi del 4-desossi-D-fruttosio 6-fosfato
Due reazioni chiave, catalizzate da enzimi, sono state combinate in una sintesi molto efficiente dello zucchero non naturale 4desossi-D-fruttosio 6-fosfato. In primo luogo l’ (R, S)-1,1-dietossi-3,4-epossibutano e’ stato risolto per trattamento con una
idrolasi da Aspergillus niger a dare l’ epossido (S) con un ee  98 %. L’ epossido e’ stato trasformato nella (S) aldeide 8 (una
aldeide non sostituita in ) che per reazione con L-eritrulosio in presenza di TK da S. cerevisiae ha fornito il 4-desossi-Dfruttosio 6-fosfato. Per portare a completamento la reazione, l' aldeide glicolica 11 che si libera viene ridotta in situ con alcool
deidrogenasi e NADH catalitico
(Eur. J. Org. Chem. 1999, 3399)

Sintesi di N-idrossi pirrolidina
Per reazione tra 3-O-benzilgliceraldeide e HPA mediata da TK proveniente da E.coli e' stato ottenuto il triolo 15, intermedio nella sintesi della N-idrossi
pirrolidina 20, un potenziale inibitore di glicosidasi.
(Tetrahedron Lett. 2000, 41, 4481)
Enzimi purificati: disimmetrizzazione di un composto
prochirale
O
O
N
F
O
N
N
N
N
N
F
N
1 SCH51048
b
OR
F
F
F
R
OH
OH
N
F
N
OTs
S
R
R
OR
a
O
N
F
40 : 60
OH
acilazione pro-R
OH
R
F
F
OH
R
N
F
R
OAc
OH
N
N
PPL
N
N
F
N
OCOR idrolisi pro-R
OCOR
S
F
F
OCOR
R
OH
N
F
R
OH
OH
N
N
R = CH3
R = C3H7
N
F
N
6R=H
7 R = Ts
OH
O
+
N
F
N
PPL
OTs
R
F
N
N
F
N
R = CH3
R = C3H7
N
N
Enzimi provati per l’acilazione selettiva: 86
Selettivi pro-R: 16
Selettivi pro-S: 12
Selezionato per miglioramento:
Amano Lipase R – selettivita’ S
Amano Lipase AK – selettivita’ R
Risultati:
Acetilazione R
alte de, 9 passaggi per il prodotto
Idrolisi R
bassa de, se estere butirrico allora
alta de ma bassa resa
Acetilazione S
alta de, buone rese
Scelta biocatalizzatore:
Acetilazione pro-S con enzima SP435
Condizioni da ottimizzare:
Temperatura, solvente, agente acilante,
carico di substrato ed enzima
Temperatura: 0 °C
Solvente:
Agente acilante:
vinil acetato
Carico substrato:
fra 0.2M e 0.9M
Carico enzima:
fra 5% e 1% (w/w)