Torricelli

TEST RAPIDI
IN DIAGNOSI
PRENATALE
Francesca Torricelli
SOD Diagnostica Genetica
Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi
www.ao-careggi.toscana.it/citogenetica
Le aneuploidie rappresentano
oltre il 90% delle anomalie
cromosomiche con difetti
congeniti
Un po’ di storia
• 1970 : possibilità di diagnosi di S. di Down su liquido amniotico
mediante analisi cromosomica
• 1980: introduzione della FISH per l’identificazione della trisomia
21 su nuclei interfasici di amniociti non coltivati
• 1993 / 1997: QF-PCR per la diagnosi prenatale di aneuploidie
• 2002: Multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA)
Diagnosi Prenatale Classica
Villocentesi
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Si esegue tra 10-12 settimane
Prelievo
Biopsia dei villi coriali
Cariotipo su preparato diretto, analisi
del citotrofoblasto metafasi
spontanee, risposta 24 ore
Cariotipo su coltura, mesenchima,
risposta dopo 8-10 giorni coltura
1% rischio di aborto
1% rischio di mosaicismo placentare
Possibilità di ripetere amniocentesi
Possibilità di eseguire IVG se il
risultato è patologico
Amniocentesi
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Metodo più usato
Dopo la 15 settimana, spesso tra
16/17
Prelievo di 1ml di liquido amniotico
per settimana gestazionale
Cariotipo dopo coltura di 8-14 giorni
0.5-1% rischio di aborto
0,2% fallimento della coltura
0.2-0.5 rischio di mosaicismo
Possibilità di ripetere amniocentesi o
sangue funicolare
Possibilità di eseguire ITG se il
risultato è patologico
Quali test
rapidi
oggi……..
Prenatal
Diagnostic
Methods
3 metodi
FISH
QF-PCR
MLPA
FISH su amniociti non coltivati
FISH in interfase: parametri per l’interpretazione dei segnali
Campioni con oltre il 60% dei nuclei aneuploidi vengono
considerati come dotati di un clone anormale
Campioni con il 10-60% dei nuclei aneuploidi vengono
considerati a mosaico
Campioni con nuclei aneuploidi inferiori al 10% sono
considerati normali sebbene la presenza di aneuploidie non
si possa escludere completamente
L’interpretazione clinica di qualsiasi risultato deve essere
eseguita unitamente all’analisi citogenetica standard
FISH interfasica
Sonde per cromosoma 13
cromosoma 21
e
Sonde per cromosoma 18
X
e
Y
Accuratezza della FISH in interfase per trisomie 13, 18, 21 e
aneuploidie dei cromosomi sessuali
Autori
Paese
Tipo di
studio
Tipo di
popolazione
Numero
Analisi fallite
o non
informative %
Sensibilità
Specificità
FN
FP
Jalal et al. 1998
USA
coorte
Alto rischio
310
0.6
100 (44/44)
100
0
0
D’Alton et al. 1997
USA
coorte
Alto rischio
315
19.4
100 (21/21)
100
0
0
Aviram-Goldring et al. 1999
Israele
coorte
Alto rischio
30
0
100 (7/7)
100
0
0
Eiben et al 1999
Germania
coorte
Alto rischio
3.280
5.7
100 (153/153)
100
0
0
Bink et al. 2000
Germania
coorte
Alto rischio
1.126
16
96.4 (27/28)
100
1
0
Bryndorf et al. 2000
Danimarca
coorte
Alto rischio
463
1
83 (29/35)
100
2
0
Feldman et al 2000
USA
coorte
Alto rischio
301
0
100 32/32)
100
0
0
Marguerat et al. 2000
Svizzera
coorte
Alto rischio
199
0
83.3 (5/6)
100
1
0
Pergament et al 2000
USA
coorte
Alto rischio
2.336
0
100 (87/87)
100
0
0
Thilaganathan et al 2000
UK
coorte
Alto rischio
3.202
0.1
99 (93/94)
99.9
1
1
Ulmer et al. 2000
Germania
coorte
Alto rischio
230
5.2
100 (34/34)
100
0
0
Cheon Leung et al. 2001
Canada
coorte
Alto rischio
309
6
100 (50/50)
100
0
0
Meyer et al. 2000
USA
coorte
Alto rischio
244
0.5
94.7 (17/18)
100
1
0
Sawa et al. 2001
Giappone
coorte
Alto rischio
1.525
4.9
100 (76/76)
100
0
0
Teppemberg et al. 2001
USA
coorte
Alto rischio
5.348
2.8
99.6 (570/572)
99.8
2
1
Weremowicz et al. 2001
USA
coorte
Alto rischio
911
3
94 (75/80)
100
5
1
Luquet et al. 2002
Francia
coorte
Alto rischio
2.000
1.6
98.5 (204/207)
99.8
3
1
Locatelli et al. 2005
Italia
coorte
Alto rischio
48
0
100 (20/20)
100
0
0
Wyandt et al 2006
USA
coorte
Alto rischio
1.788
ND
98.7 (75/76)
100
1
0
Legenda: FN falsi negativi; FP falsi positivi; ND non disponibile
Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)
QF-PCR
Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction
(QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente
la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni
(trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi
sessuali)
Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari:
la diagnosi può essere completata in 2-3 giorni
Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi
sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti
di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono
specifiche per il cromosoma che si intende
analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13,
18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più
frequenti.
QF-PCR
Quantitative fluorescent PCR
Amplificazione di STR
localizzati in differenti
regioni del cromosoma 21
mediante PCR
Ratio:
Ratio:
1 : 1
1 :
2
:
1
Trisomia del cromosoma 18
1:1:1
1:2
I marcatori diallelici si considerano trisomici quando il rapporto
fra le aree dei due picchi è <0.65 o >1.8
Triploidia
Cr. 21
Cr. 21
Cr. 18
Cr. 13
Cr. 21
1:2
1:1:1
1:1:1
1:2
2:1
Cr. 18
Cr. 13
Cr. 18
Cr. 13
2:1
2:1
1:1:1
1:2
Cr. 18
Cr. 21
1:2
1:2
Cr. 18
Cr. 13
1:1:1
Non inf.
Criticità del metodo
Contaminazione con DNA materno
Interpretazione della
monosomia X e diagnosi della
Sindrome di Turner
Criticità del metodo
Assenza del segnale dell’Y
AM
XY
Cr.
X
Cr.
13
Cr.
7
Sindrome di Turner ?
Cr.
X Cr.
X
Cr.
X
Cr.
X
2:1
1:1
XX
Turner
Cr. 7
Contaminazione con DNA materno
Cr.
13
Cr. X
Cr. 7
Cr. X
Accuratezza della QF-PCR per trisomie 13, 18, 21 e aneuploidie dei cromosomi
sessuali
Verma et al. 1998
2.139
2139
/
/
/
21: 2-3
32/33
Pertl et al. 1999
247
/
247
/
/
21: 4
13: 2
18: 3
15/15
1/1
4/5
Levett et al. 2001
5.000
5.000
/
/
/
21: 6
13: 6
18: 6
X:5-Y:2
57/57
8/8
17/17
20/20
Voglino et al. 2000
1.563
1.302
61
10
280
21:
13:
18:
XY:
110/110
15/15
40/40
25/25
Curcio et al 2004
1.277
996
281
/
/
21: 4
13: 3
18: 3
XY: 5
26/26
2/2
8/8
6/6
Cirigliano et al. 2004
18.000
16.746
625
123
/
21: 6
13: 4
18: 5
XY: 8
344/344
61/61
162/162
224/224
Ogilvie et al. 2005
9.080
7.327
1.753
/
/
21: 2-4
13: 2-4
18: 2-4
XY: 10
333/333
54/54
130/130
36/36
Choueri et al. 2006
420
420
/
/
/
21: 8
13: 5
18: 5
20/20
1/1
3/3
Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)
MLPA
Mulptiple ligation-dependent probe amplification
• Esistino kit commerciali per la
diagnosi rapida di aneuploidie
con MLPA
• Non necessita di informatività
dei markers usati perché
quantifica i segmenti
analizzati
• Presenta le stesse limitazioni
della QF-PCR
• Non evidenzia
contaminazione materna
• Non permette di diagnosticare
triploidie
MLPA
Rischio residuo per anomalia cromosomica dopo
FISH in interfase o QF-PCR
Discordanti
Falsi Negativi
Discordanti
Autori
Paese
Totale
Normali
concordan
ti
Anormali
concordanti
S
ND
NS
FP
Evans et al. 1999
USA,UK,
svizzera,
svezia
146.128
141.965
2.889
/
1.274
/
0
Thilaganathan et al 2000
UK
3.200
3.088
93
5
/
13
1(0.03%)
Thein et al. 2000
UK
1.687
1.576
97
7
/
7
0
Lewin et al. 2000
Francia
27.407
26.268
818
99
/
222
0
Ryall et al. 2001
Australia
3.380
3.251
104
6
/
19
0
Cheong et al 2001
Canada
294
234
50
9
/
1
0
Witters et al. 2002
Belgio
5.036
4.853
125
9
/
49
0
Leung eta l. 2003
Hong kong
1.526
1.461
61
2
/
2
0
Homer et al. 2003
USA
21.609
20.860
524
145
/
80
0
Grimshaw eta l. 2003
UK
3.764
3.666
86
/
12
/
0
Leung et al. 2004
UK
1.548
1.466
60
13
/
9
0
Cirigliano et al. 2004
Spagna,
Italia
17.917
17.129
732
/
56
/
/
233.496
225.817
(96.7%)
5.639 (2.4%)
2.039
(0.9%)
Totale
Totale S e NS
295 (0.4%)
1 (0%)
402
(0.6%)
Legenda: S clinicamente significativo; NS clinicamente non significativo
ND non disponibile; FP falsi positivi
Modificato da: Lisa G.Shaffer and The-Hung Bui, A.J.M.G. 145C:87-98 (2007)
Test rapidi in diagnosi prenatale
Vantaggi
• Tempi rapidi di risposta
• Risultato entro 2-3 giorni
• Il rischio di falsi positivi e falsi
negativi riportato in letteratura è
basso
• E’ necessario poco materiale di
partenza
• QF-PCR è meno costosa e
laboriosa della FISH e della
citogenetica classica
• QF-PCR può essere
automatizzata
• La QF-PCR può essere eseguita
anche se nel campione è presente
una certa contaminazione da
sangue materno
Svantaggi
• Identificano solo le
aneuploidie dei cromosomi in
analisi
• Non è in grado di
diagnosticare traslocazioni e
delezioni
• La contaminazione con DNA
materno può rappresentare un
problema
• La presenza di mosaicismo
fetale è un problema
• La FISH non si può eseguire
se è presente una piccola
contaminazione da sangue
materno
Linee guida
7. QF-PCR FOR RAPID PRENATAL
DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY
This technique is a useful
adjunct to prenatal diagnosis
and is a more appropriate
technique than FISH when
dealing with large numbers of
prenatal
referrals.
Internal
validation is essential before
using this technique. Close
liaison with Molecular Genetics
colleagues is necessary to
establish this technique in a
cytogenetic laboratory.
The limitations of QF-PCR in
identifying
chromosome
abnormalities must be clearly
known. It is recommended that
testing for trisomies 13, 18 and
21 is carried out, whilst it is
acceptable to test for sex
chromosome aneuploidy in only
a subset of referrals. QF-PCR
analysis provides information
only about the probe locus in
question. It does not substitute
for a complete chromosome
analysis.
For amniotic fluid, between 0.5 and 4 ml or
1/10 of the sample is recommended for
QF-PCR analysis, ……………
For chorionic villus samples, it is
recommended that at least two chorionic
villi taken from different regions of the
biopsy should be processed to minimise
the risk of misdiagnosis due to confined
placental mosaicism…………..
A chelex-based method is recommended
for DNA preparation as this does not
require any tube-tube transfers…………
7.3 ANALYSIS
It is recommended that both the electrophoretogram and peak
measurements,…………………..
To interpret a result as abnormal, at least two informative marker results should be
consistent with a triallelic genotype, with all the other markers uninformative. It is
unacceptable to interpret a result as abnormal if shown by only one marker. Confirmation of
sample identity when a result is abnormal by repeat PCR of the DNA, re-extraction of
samples, or maternal blood analysis is recommended. …………………
To interpret a result as normal at least two informative marker results consistent with a
normal diallelic pattern are required, with all other markers uninformative.
7.4 REPORTING
….. report normal QF-PCR results as ‘consistent with a normal diploid complement for
chromosomes 13, 18 and 21’, ‘an apparently normal complement of chromosomes 13, 18
and 21 was detected’, ‘no evidence of trisomy’ or similar statement………
Abnormal reports should include an interpretative statement such as ‘consistent with
Down syndrome’, ‘associated with Down syndrome’, ‘indicative of Down syndrome’ or
‘predicted to be affected with Down syndrome’.
7.1 Blood-stained Amniotic Fluid Sample
It is acceptable to process all blood-stained samples, though care must be taken when
interpreting the results as the blood may be fetal or maternal in origin. Levels of bloodstaining in the cell pellet may also correlate with the level of the maternal genotype, though this
should be carefully validated before being applied to interpret results. ………………..
The presence of two genotypes in DNA from bloodstained samples is consistent with
maternal cell contamination. Results from bloodstained samples can be divided into three
categories; ………………………
7.2 Chorionic Villus samples
Maternal material may be present in CVS material prepared for QF-PCR analysis if the sample
is of poor quality and/or the removal of maternal decidua is incomplete. Maternal cell
contamination in CVS of reasonable quality is generally avoidable and may compromise the
QF-PCR and/or karyotype results; every effort should be made to consistently remove all
maternal decidua from CVS.
8 MOSAICISM
Mosaicism for trisomy and normal cell lines can be detected by QF-PCR analysis, evident as
extra peaks and skewed allele ratios on a chromosome-specific group of markers.
These results may be subtle; skewed allele ratios representing the mosaic chromosome may
remain in the normal or abnormal ranges (i.e. ratios may all be borderline inconclusive or
where the greater area/height is noted to be associated with the larger
allele)…………………….
If the QF-PCR result can be confidently interpreted the mosaic result should be reported,
although the clinical significance of a mosaic result should be carefully considered in the
report. ……………………..
Rare completely discrepant QF-PCR and karyotype results due to placental mosaicism in
CVS have been reported ………………………..
Linee guida per la diagnosi citogenetica
Consensus 2007
Sociatà Italiana di Genentica Umana
6.6 identificzione rapida di aneuploidie
6.6.1 FISH Interfasica per l’aalisi delle aneuploidie dei cromosomi 13,18,21,X,Y
.. può essere utilizzata per la ricerca rapida delle principali aneuploidie, il risultato è
disponibile in 24-48 ore…….. Può essere utilizzata su trofoblasto nel caso in cui siano
assenti metafasi o per estendere l’analisi di un caso di mosaicismo.
Questa indagine non costituisce un’alternativa all’analisi completa del cariotipo, ma è un test
integrativo, preliminare e parzialeche può essere utile quando viene richiesta una diagnosi
specifica urgente.
6.6.2 PCR Quantitativa florescente (QF-PCR)
……………..fornisce informazioni limitate ai “sequence tagget site” (STS) utilizzati e che per
la definizione dell’assetto cromosomico deve essere associata alla citogenetica
convenzionale
….. È necessaria una quantità di liquido amnioticotra 0,5 e 4ml, mentre nel trofoblasto si
raccomanda di eseguire l’estrazione di DNA da almeno due frammenti di villo coriale per
limitare il rischio di errori diagnostici correlati ai mosaicismi confinati alla palcenta
Linee guida per la diagnosi citogenetica
Consensus 2007
Sociatà Italiana di Genentica Umana
6.6 identificzione rapida di aneuploidie
6.6.3 Multiple Ligation Probe-dependent Assay (MLPA)
…… è una tecnica rapida e relativamente economica che permette di quantificare il numero
di copie di oltre 45 sequenze di DNA in un’unica reazione di PCR………………………..
…………… sono sufficienti 20ng di DNA………..
…….è in gradi di discriminare anche una singola copia di DNA………….
Può firnire una diagnosi rapida delle aneuploidie , ma deve sempre essere associata alla
diagnosi citogentica tradizionale
External quality assessment of rapid
prenatal detection of numerical
chromosomal aberrations using
molecular genetic techniques:
3 years experience.
Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8. Ramsden SC, Mann K,
McConnell C, Hastings R.
National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK ,
External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular
genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8
•5 campioni inviati ai partecipanti per anno, costituiti da DNA estratto da amniociti non coltivati e
da villo coriale
•I partecipanti devono genotipizzare i campioni con i metodi utilizzati di routine e inviare i
risultati con i form di risposta utilizzaticon l’iterpretazione completa del risultato
•Tutti i report di risposta sono anonimi
•Nel 2004 è stata valutata l’accuratezza della genotipizzazione, nel 2005 e 2006 la
valutazionedei risultati è stata fatta in base alla linee guida :
External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular
genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8
Risultati
Fallimenti tecnici 4/265 (1.5%)
Errori di genotipizzazione 1/265 (0.4%) relativo al 2006 non è stato
identificato il mosaicismo della trisomia 18
Commenti
•Aumento di partecipazione negli anni
•Basso il numero di fallimenti tecnici e il numero di errori di
genotipizzazione
•Completa interpretazione del risultato da parte del laboratorista, in quanto
il clinico di riferimento, vista la specificità del dato può non essere in grado
di interpretare correttamente l’aspetto tecnico
•EQA valuta sia gli errori di genotipizzazione che la qualità d’interpretazione
del dato clinico
External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using molecular
genetic techniques: 3 years experience. Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8
External quality assessment of rapid prenatal detection of numerical chromosomal aberrations using
molecular genetic techniques: 3 years experience.
Prenat Diagn. 2007 May;27(5):404-8.
National Genetics Reference Laboratory (Manchester),UK ,
Schema pilota di EQA per la diagnosi rapida di aneuploidie, inizialmente
per i laboratori del Regno Unito e successivamente esteso a tutta Europa
EQA (external quality assessment)
Monitorare la qualità
del test eseguito
Migliorare la qualità
del test eseguito
La partecipazione dei laboratori a EQA è essenziale per l’accreditamento dei
laboratori in base ai criteri ISO15189