Sequenziamento automatico del DNA e sue applicazioni in ambito

UN PO’ DI STORIA...
1900
- Riscoperta delle leggi della trasmissione ereditaria dei caratteri, che Mendel aveva pubblicato nel
1865 e che avevano come assunto l'esistenza di fattori discreti, elementen, i geni, che determinano i
caratteri e che si trasmettono da una generazione all'altra.
1902
-
Sutton ipotizza che i fattori mendeliani, i geni, siano localizzati sui cromosomi.
1910-1911
-
Morgan inizia a mappare i geni sui cromosomi del moscerino della frutta D.Melanogaster
1944
-
Avery MacLeod e McCarty stabiliscono che il DNA è il materiale ereditario.
1953
-
Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica per il DNA
1956
- Viene stabilito che il patrimonio cromosomico completo dell'uomo è di 46 cromosomi.
1961-1966
- Viene decifrato il codice genetico, ovvero stabilito il rapporto tra le 64 triplette possibili a partire dalle
4 basi nucleotidiche del DNA, e i 20 aminoacidi che formano le proteine.
1967
-
Mary Weiss e Green introducono la tecnica dell'ibridazione delle cellule somatiche che rende più agevole
la mappatura dei geni umani.
1972
-
Berg
costruisce la prima molecola DNA ricombinante in vitro utilizzando gli enzimi di restrizione. Vengono
realizzati con successo i primi esperimenti di clonazione del DNA.
1973
Cohen, Chang e Boyer costruiscono il primo batterio ricombinante. Si tiene la prima conferenza sulla
-
mappatura dei geni umani.
1974
-
Cohen e Boyer ottengono l'espressione di un gene estraneo trapiantato in un batterio con la tecnica del
DNA ricombinante.
1975
- Si tiene la conferenza di Asilomar che propone una moratoria sugli esperimenti con il DNA ricombinante in
assenza di linee guida per la sicurezza delle manipolazioni genetiche.
1977
- Per la prima volta un gene umano viene ricombinato e inserito in un batterio per clonare una proteina, la
somatostatina Sanger, già premio Nobel come inventore del metodo per sequenziare le proteine, sviluppa un
metodo nuovo ed efficiente per sequenziare il DNA (contemporaneamente Gilbert e Maxam inventano
un metodo analogo).
1978
-
Boyer costruisce una versione sintetica del gene dell'insulina e lo inserisce in un batterio. La Genentech,
fondata nel 1976 dallo stesso Boyer insieme a Swanson, otterrà il permesso di commercializzare l'insulina
prodotta per ingegneria genetica nel 1982 e quindi il brevetto
1978-1980
- Vengono sviluppate nuove tecniche basate sull'ibridazione molecolare e l'utilizzazione come marcatori delle
variazioni individuali del DNA per mappare fisicamente i geni e le sequenze geniche sui cromosomi. Grazie
alle nuove tecniche e alla collaborazione internazionale tra i mappatori, i geni mappati passano da 579 nel
1981 a 1.879 nel 1991: tra questi vengono mappati il gene della corea di Huntington (1983), il gene per la
distrofia muscolare (1987) e il gene per la fibrosi cistica (1989).
1980
- Viene concesso il primo brevetto su una forma di vita geneticamente modificata, un microrganismo che si nutre
di petrolio. Mullis inventa la tecnica della PCR.
1981
- Viene prodotto il primo animale transgenico.
1983
- Viene inventato il primo sequenziatore automatico.
1989
- Viene creato il National Center for Human Genome Research (NCHGR), guidato da James Watson per mappare
e sequenziare tutto il DNA umano entro il 2005
1992
- Craig Venter crea l'Institute for Genomics Research.
1993
- Francis Collins assume la direzione del National Human Genome Research Institute (ex NCHGR).
1995
- Viene pubblicata la prima sequenza completa del genoma di un organismo vivente diverso da un virus, il
batterio Haemophilus influenzae.
1996
- Viene riportato il sequenziamento completo del primo organismo complesso, il lievito Saccharomyces
cerevisiae.
1997
- Viene costruito il primo cromosoma umano artificiale e annunciata la clonazione di un mammifero, Dolly .
1986
- Viene proposto da diversi biologi molecolari, tra cui Renato Dulbecco, di sequenziare completamente il
genoma umano.
1988
- Viene concesso il brevetto per un topo transgenico altamente suscettibile al tumore del seno.
1998
- Viene pubblicata una prima bozza della mappa del genoma umano, che mostra la localizzazione di più di 30.000
geni. Viene pubblicata la sequenza completa del primo genoma di un animale, il verme Caenorhabditis elegans.
Venter e la Perkin Elmer Corporation fondano la Celera Genomics con l'intento di sequenziare tutto il genoma
umano in tre anni con il metodo del whole genome shotgun.
2000
- Viene pubblicata la sequenza completa del genoma di Drosophila melanogaster e viene annunciato dalla Celera
Genomics il sequenziamento di tutte le basi nucleotidiche del DNA umano con il metodo whole genome shotgun.
Date storiche della
sequenza del DNA
Avery propone il DNA
come materiale genetico
1944
1869
1953
Holley sequenza il tRNA
di lievito
1965
1970
METODO SANGER
(terminazione di catena)
METODO MAXAM-GILBERT
(degradazione chimica)
KARY MULLIS
Introduce la PCR
1977
1980
1986
Automazione completa
Sequenziamento completo
del genoma umano
1989
2000
Miescher osserva
per la prima volta il DNA
Watson e Crick determinano la
struttura della doppia elica
Vengono sviluppate le tecniche
per la sintesi degli oligonucleotidi e per
la degradazione chimica del DNA. Viene
introdotta l’elettroforesi su gel per la
Separazione di frammenti di DNA
Il DNA genomico viene clonato nel fago M13
o in vettori plasmidici, nascono i primi programmi
informatici di analisi dei dati, vengono sviluppate
nuove tecnologie per il sequenziamento
AUTOMAZIONE PARZIALE
Vengono sviluppate le prime apparecchiature
per il sequenziamento che impiegano sistemi
per la rilevazione della fluorescenza.
Sequenziamento
 Estrazione di DNA o RNA
 PCR o amplificazione mediante clonaggio
 Purificazione del campione di DNA
 Cycle Sequencing
 Precipitazione dei prodotti di cycle sequencing
 Sequenziamento automatico
 Analisi dei dati
Sequenziamento del DNA
Metodi tradizionali ed odierni
Metodi di Maxam-Gilbert e di Sanger
Hanno in comune la generazione di una scaletta di frammenti di DNA
A singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base.
Frammenti di dimensioni crescenti possono essere separati mediante
Corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide.
A corsa ultimata il gel viene posto a contatto con una pellicola radiorafica
Sulla quale lascia impressa la disposizione delle bande.
L’immagine ottenuta, letta di seguito darà la sequenza delle basi.
Il metodo Maxam-Gilbert
(o metodo di sequenziamento a degradazione chimica)
Questo metodo, basato sulla degradazione chimica di frammenti di
DNA a doppio filamento, è ormai poco utilizzato, perché non adatto
al sequenziamento automatico e perché utilizza composti chimici
dannosi alla salute
Si differenzia da tutti gli altri metodi perché non utilizza sintesi
enzimatiche ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli
nucleotidi.
I frammenti di DNA a doppio filamento possono essere generati per
frammentazione o digestione enzimatica. In entrambi i casi le molecole a
doppio filamento devono essere convertite in molecole a singolo filamento
e marcate terminalmente
 Marcatura terminale al 5’ o al 3’ del DNA a doppio filamento
 Denaturazione e separazione dei due filamenti
 Il DNA a singola elica viene suddiviso in quattro campioni, ognuno
dei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una o
due delle 4 basi del DNA.
G
G+A
C+T
C
= DMS + piperidina
= DMS + piperidina + acido formico
= idrazina + piperidina
= idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M
 Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazione parziale:
statisticamente tutte le possibili basi saranno degradate producendo una
serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalla distanza tra l’estremità
marcata e il sito di taglio
 Separazione dei frammenti marcati mediante gel elettroforesi e
 Visualizzazione dei risultati mediante autoradiografia
Il metodo
Maxam-Gilbert
Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di
nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo
filamento
Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da
•Elevata processività
•Bassa attività esonucleasica 5’-3’
•Bassa attività esonucleasica 3’-5’
(es. Klenow, Sequenasi)
Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad
Uno stampo a singola elica
ha bisogno di:
un innesco specifico (primer)
La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con
35S
Sintesi del filamento marcato
PRIMER
DNA Polimerasi
5’-A T C T T T T A G A G T A C C
3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
PRIMER
DNA Polimerasi
5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A
3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
Il metodo Sanger
(o metodo a terminazione di catena)
Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad
• uno stampo a singola elica
• un innesco specifico (primer)
•
la marcatura con un dNTP* marcato, di solito con
35S
ha bisogno di:
• una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza
Terminazione della catena
La sintesi del filamento complementare, tuttavia non prosegue
indefinitamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro
distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossi nucleotidi
trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché
posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’
PRIMER
5’-A
3’-T
T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A
DNA Polimerasi
A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
+ ddNTP ( per es. ddCTP)
STOP
5’-A
3’-T
T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A T G T AddC
A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’
Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno
in corrispondenza di ogni dCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
ddCTP
Schema di sequenziamento a terminazione di catena
DNA stampo a
singola elica
3’-GGCTAAC
5’
Ibridazione con
Il primer
3’
3’-GGCTAAC
+
[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTTP(dNTP)+Sequenasi
ddATP, dNTP
ddCTP, dNTP
-CCG ddA
-ddC
-C ddC
A C
ddGTP, dNTP
ddTTP, dNTP
-CC ddG
-CCGATT ddG
G
-CCGA ddT
-CCGAT ddT
T
-CCGATT ddG
-CCGAT ddT
-CCGA ddT
-CCG ddA
-CC ddG
-C ddC
-ddC
G
T
T
A
G
C
C
Sequenza: 5’-CCGATTG
Direzione di
lettura
Sequenziamento manuale
Pratica ormai superata dal seq. automatico
Marcatura Radioattiva
Primer marcati con 32P
oppure 35S dNTP
Colorazione Silver Staining
Evidenzia direttamente su gel le bande senza ulteriori
modificazioni, attraverso la precipitazione di Ag
Nuovi metodi di sequenziamento
Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimmetrica)
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Il pirosequenziamento
Sequenziamento automatico
1 Colorante - 4 Corsie
Per ogni campione si eseguono 4 reazioni di
estensione separate (una per ogni ddNTP)
utilizzando un unico colorante
L’uso di 4 corsie aumenta
però la variabilità di corsa
Sequenziamento automatico
4 Coloranti - 1 Corsia
Unica reazione ed unica corsa;
Ad ogni nucleotide è associata una diversa
colorazione:
ddATP
ddTTP
ddGTP
ddCTP
Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la
variabilità di corsa
Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti
Coniugando a ciascun ddNTP
un diverso marcatore fluorescente, è
possibile effettuare le quattro reazioni di
sequenziamento in un unico tubo da saggio
e caricare il tutto in un solo pozzetto di gel
ddA
ddT
ddC
ddG
Sequenziamento automatico
Metodi di Marcatura
 Marcatura dei Primers
primers progettati con “tag” colorati a:
Fluorescenza UV
Fluorescenza IR
minore Background
maggiore Sensibilità
 Marcatura dei Terminatori
ddNTPs marcati con fluorofori o differenti coloranti
Sequenziamento automatico
Terminatori BigDye
Sistemi a trasferimento di energia a singola molecola,
costituiti da accettore e donatore legati da un linker
Vantaggi:
Segnale omogeneo, basso
rumore di fondo, luminosità
maggiore, facilità
interpretativa per A e G
attigue
D
A
Dalla cycle sequencing
all’elettroforetogramma...
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le
informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore
diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.
Sequenziamento automatico
Prevede l’utilizzo di marcatura a fluorescenza
rilevata automaticamente da un laser
Sequenziatori a Gel
reazione e caricamento dei campioni sono eseguite manualmente
Esistono kits in commercio che permettono di velocizzare e
standardizzare tali operazioni fornendo mix di reazione, soluzioni di
poliacrilammide a cui aggiungere soltanto Temed o gel preformati
Gel per elettroforesi
“slab” gel di poliacrilammide
(dal 4% al 6%) molto sottili in
condizioni denaturanti (Urea)
Apparati verticali di
lunghezza variabile a seconda
del numero di basi da leggere
(22 cm-1 m)
Il forte campo elettrico a cui
vengono sottoposti produce
elevato calore che deve essere
dissipato con piastre di alluminio
o ventole
Sequenziamento automatico
Sequenziatori Capillari
 l’intervento dell’operatore è minimo
 il sistema carica automaticamente il
capillare con il polimero di corsa
 esegue la separazione elettroforetica
 i frammenti marcati di DNA vengono
rilevati man mano che corrono lungo il
capillare
Sequenziamento automatico
Sequenziatori Capillari
1 Capillare
16 Capillari
96 Capillari
(Scala di Produzione)
Richiede campioni privi di: sali, molecole cariche negativamente,
proteine, detergenti e templates non marcati
Sequenziamento automatico
Sistemi di Rilevamento
 Camera CCD ( Charge - Coupled Device)
Altissima
risoluzioneImmagine
Elettroferogramma
Sequenza in pochi minuti
 Camera a Lettura Multipla
Assenza di Filtri
Uso di qualsiasi
colorante
Doppio Laser Doppio Rilevatore
Es. NIR o SBS
Sequenziamento automatico
Software
Controlla e ottimizza i parametri elettroforetici
Normalizza le bande
Sottrae il background
Corregge l’effetto “Smile”
Adatta gli algoritmi se mobilità e
spaziatura dei picchi escono dal range
Reazione fallita: non presenta
picchi definiti e ha un alto
rumore di fondo
Possibili Cause
Possibili Soluzioni
• Il primer non trova sito di
annealing
• Cambiare primer
• Il DNA presenta contaminazioni
di vario tipo
• Ripreparare il DNA
• La quantità di DNA e' insufficiente
• La quantià di primer è insufficiente
• Aumentare la quantità di DNA
• Aumentare la quantità di
primer
• Il primer è stato disegnato male,
es. temperatura di melting troppo
bassa
• Ridisegnare il primer
Campione che presenta rumore
di fondo sufficientemente alto
da causare ambiguità (N) nel
riconoscimento dei picchi da
parte del software
Possibili Cause
Possibili Soluzioni
• Aumentare la quantità di DNA
• La quantità di DNA e'
insufficiente e il segnale troppo
debole
• Purificare meglio il DNA
• Il DNA presenta
contaminazioni che inibiscono la
reazione
• Ci sono altri templati contaminanti • Ripreparare il DNA
Perdita di risoluzione
precoce per cui i picchi
sono sempre
meno definiti
Possibili Cause
• Il DNA presenta
contaminazioni che inibiscono
la reazione
Possibili Soluzioni
• Purificare meglio il DNA
Sequenza
doppia
dopo un
tratto
buono
Possibili Cause
• Clone o PCR multiple con
stesso tratto iniziale, es.
vettore
Possibili Soluzioni
• Ripreparare DNA in modo da
avere un tipo di templato unico
• Siti multipli di attacco del primer sul DNA
• Mutazione frame shift
• Slittamento dopo una regione omopolimerica
• Cambiare primer
Sequenza fuori scala
Possibili Cause
• Troppo DNA
• Struttura secondaria
che blocca la reazione
Possibili Soluzioni
• Riquantizzare e ridurre la
quantità di DNA
• Pretrattare con DMSO
Regione ricca in GC
Possibili Cause
• Struttura secondaria che
impedisce l'avanzamento della
polimerasi perchè, per effetto
dell'alta Tm del tratto di DNA, i
due filamenti non si separano
bene
Possibili Soluzioni
• Sequenziare un prodotto di PCR
amplificato sostituendo il 75%
del dGTP con 7-deaza-dGTP
• Modificare il ciclo standard
di sequenziamento con
temperature più alte
Sequenziamento automatico:
Applicazioni in ambito biomedico
Sequenziamento di DNA o cDNA sconosciuto ( es. per
caratterizzare regioni del DNA e trascritti genici
precedentemente localizzate con analisi di linkage)
• Primer walking
• Shotgun sequencing
utilizzo di vettori di clonaggio
• Vettori fagici a singolo filamento
• Vettori plasmidici a doppio filamento
• Vettori fagomidici
• Vettori per grossi inserti di DNA
Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per
analisi mutazionale
utilizzo di PCR
Mapping
Tecnica del “Chromosome
Walking”
Sequenziamento di
Library
Progetto Genoma
Sequenziamento Ex Novo
Uso di Primers Universali
Es. M13
Tecnica del “Random
Sequencing”
Sfrutta l’Overlapping
dei vari frammenti
Assemblaggio ed
Allineamento delle sequenze
tramite Computer
Le finalità principali del progetto genoma
riguardano l'acquisizione i informazioni utili
per individuare l'eventuale implicazione di
alterazioni nella sequenza del DNA nello
sviluppo di patologie genetiche nell'uomo, e
per comprendere le basi genetiche
dell'evoluzione e del funzionamento
dell'organismo umano
Sintesi di Oligonucleotidi
analisi dell’espressione genica
Probe per Microarray
farmacogenomica
SNPs
Oligonucleotidi antigene/antisenso
Dare un senso ai dati di sequenza non è facile!!
Isole CpG:
la citosina può essere metilata nei geni inattivi
Sequenze di siti di splicing in 5’ e 3’:
come marcatori per gli introni e le zone di confine con gli esoni
ORF:
mRNA
CUUAGCGUAGCUACUAGACUAG
fase 1
CUU/AGC/GUA/GCU/ACU/AGA/CUA/G
fase 2
CU/UAG/CGU/AGC/UAC/UAG/ACU/AG
fase 3
C/UUA/GCG/UAG/CUA/CUA/GAC/UAG
Open reading
frame
Perché sequenziare anche organismi
diversi da Homo Sapiens?
Ad esempio per confrontare le
sequenze altamente conservate,
è più probabile che codifichino
proteine funzionalmente importanti
Sequenziamento di DNA o cDNA sconosciuto ( es. per
caratterizzare regioni del DNA e trascritti genici
precedentemente localizzate con analisi di linkage)
• Primer walking
• Shotgun sequencing
utilizzo di vettori di clonaggio
• Vettori fagici a singolo filamento
• Vettori plasmidici a doppio filamento
• Vettori fagomidici
• Vettori per grossi inserti di DNA
Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per
analisi mutazionale
utilizzo di PCR
Comparativa
e/o Mutazionale
Uso Diagnostico
Applicazione non di routine
Monitoraggio pazienti in
terapia
Test di Genotyping Es.
HIV
Implicazioni
Terapeutiche
Dimensione della mutazione
Poliploidie
Genoma
Cromosoma
Gene
Aneuploidie
Bandeggio cromosomico
Fish di interfase
Riarrangiamenti cromosomici
Fish cromosomica
Piccole delezioni/duplicazioni
Delezioni/duplicazioni geniche
Genetica molecolare
Delezioni/duplicazioni nucleotidiche
Mutazioni nucleotidiche
Sequenziamento
Mutazione
di un
singolo
nucleotide
Mutazioni per inserzione o delezione di nucleotidi in eterozigosi
Sequenziamento del tratto nucleotidico delle
immunoglobuline (Ig) relativo al riarrangiamento della
regione variabile CDR3 specifica del clone tumorale, da
utilizzare in neoplasie linfoidi di tipo B per il monitoraggio
della malattia minima residua e come base per la
produzione di vaccini anti-idiotipici paziente-specifici.
Sequenziamento
della VH-CDR3
Pession et al, Leuk Lymphoma 2003
Sequenziamento regione CDR3 del TCR per
caratterizzazione cloni di linfociti T in vitro/vivo
CDR 3
REGIONI CHE
DETERMINANO
LA
COMPLEMENTA
RIETA’
Sequenziamento regione CDR3 del TCR per
caratterizzazione cloni di linfociti T in vitro/vivo
Montagna et al int.j of cancer 2004
Genotipizzazione del genoma virale del lentivirus HIV,
responsabile della sindrome da immunodeficienza
acquisita umana (AIDS)
una delle caratteristiche di questo virus è quella di
andare in contro spesso a mutazioni casuali nel proprio
genoma.
ne consegue la selezione di ceppi resistenti ai farmaci
HIV
ViroSeq Kit (Applied
Biosystems Inc.)
Individuazione Resistenze
farmaci in pazienti non
rispondenti
TRUGENETM HIV-1 Genotyping Kit
(Visible Genetics Inc)
HIV
Software allinea
sequenza con WT
Rileva Mutazioni
Regole che correlano singole o
combinazioni di mutazioni al grado di
resistenza per ogni farmaco
Accesso a Banca
Dati
Valutazione dello stato di metilazione di un gene ed
in particolare del suo promotore
Tecnica del bisufilto
Il trattamento con bisulfito converte le citosine non metilate in timine
Le citosine metilate (quelle delle isole CpG) rimangono tali
Attenzione nel progettare i primers !! (escludere le parti con CpG)
Decitabina: demetilante inibendo la DNA metil-transferasi
LAM in particolare con riarrangemento di MLL
Dott.ssa Formica, dott.ssa Dan, lab. Oncoped.
Elenco dei siti
che contengono
informazioni sul
Progetto
Genoma Umano
e sui frammenti
di DNA
sequenziati.
The Huma n Genome Project
http://www.nhgri.nih.gov
un sito dedicato al Progetto Genoma
Umano gestito dal NHGRI (The
National Huma n Genome Research
Institute)
GenBank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
un sito in cui si possono trovare
sequenze di DNA e di proteine.
EMBL
http://www.ebi.ac.uk
GDB (genome database):
http://www.gdb.org/
dbEST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/i
ndex.html
OMIM (on-l ine Mendelian
Inheritance in Man)
accesso attraverso GDB
MGD (Mouse Genome D ata base)
http://www.informa tics.jax.org
un sito dove sono raccolte le
sequenze del genoma umano.
il più impo rta nte database
concernente la mappatura del
genoma .
raccoglie le sequenze parziali
ottenute dai cDNA
catalogo elettronico di Mendelian
Inheritance in Man di Victo
McK usick, un elenco delle ma lattie
umane ereditarie.
database del genoma mu rino,
Généthon
CHLC (Co-operative Huma n Linkage
Center)
CEPH
CELERA
bibliografia sul progetto genoma
umano
Whitehead Institute
http://www.genethon.fr/
http://lpg.nci.nih.gov/CHCL/
http://www.cephb.fr/bio/cephgenethon-map.html
http://www.celera.com/
mappa genetica basata sui marcatori
con ripetizioni (CA)n
database contenente una mappa
genetica e dati riguardanti il
genotipo e i marcatori genetici,
contenente un programma p er
l’analisi di linkage
mappa fisica del genoma umano
basato sugli YAC.
il sito internet della società privata
americana diretta da Greg Venter
www .nature.com/genomics/0
http://www-genome.w i.mi t.edu/
mappa fisica del genoma umano
basata sugli YAC
Il clonaggio dell’intero genoma umano non è difficile
tecnicamente e sono disponibili genoteche in fagi od in
cromosomi artificiali di lievito abbastanza ampie da
contenere diverse volte il genoma umano; ma il DNA di
queste genoteche è stato clonato in modo casuale dal
genoma.
Perché abbia un senso il DNA in questi cloni deve essere
strutturato nell’ordine corretto, in modo da poter
ricostruire il genoma , o suoi frammenti che siano
abbastanza ampi da contenere porzioni di sequenze
biologicamente interessanti.
Sospetto clinico
(sintomatologia, storia familiare)
Isolamento dal sangue periferico
di linfociti circolanti
Analisi del
cariotipo
Estrazione del DNA
Amplificazione tramite PCR
Southern blot
Corsa su gel
Diagnosi
citogenetica
SSCP
RFLP
sequenziamento
Creazione o
distruzione di
un sito di restrizione
diagnosi di delezioni
inserzioni duplicazioni
identificazione di
nucleotidi alterati
diagnosi di specifiche
mutazioni puntiformi