Sviluppi nella automazione dei Micobatteri Prof. Giovanni Fadda

Use the Best First (UBF)
Workshop Antiinfettivi 2005
Roma 09-11 Marzo 2005
Microbiologia delle Micobatteriosi
Prof. Giovanni Fadda
Istituto di Microbiologia – U. C. S. C. - Roma
Active TB
30 millions
New cases/year
8 millions
Deaths/year
3 millions
Un terzo della popolazione mondiale è infettato
con M. tuberculosis
Dye C., et al.. (1999) JAMA Vol. 282, pp:677-686
TUBERCOLOSI NEL MONDO
Ogni giorno:
25000 persone si ammalano di TB attiva;
circa 5000 muoiono di TB.
300,000 persone si infettano ogni anno con ceppi MDR-TB
Testimonianze archeologiche della tubercolosi
• Lesioni ossee in scheletri fossili
risalenti a circa 8000 a.C.
• Degenerazioni riconducibili alla
tubercolosi in mummie egizie del
2500 a.C.
• Rinvenimento di batteri con
caratteristiche simili al M.
tuberculosis in lesioni ossee di una
mummia di un bimbo inca del 700 a.C.
• Determinazione di DNA di M.
tuberculosis complex in tessuto
osseo di un bisonte estinto, datato
15000 anni a. C.
(B. M. Rothschild et al., CID 2001, 33:305-11)
La scoperta del M. tuberculosis
• 1819: Teofilo Lennec
ipotizza l’unicità delle
manifestazioni cliniche
della malattia
• 1865: Jan Antonine
Villemin induce in
conigli la Tubercolosi
e fornisce per la
prima volta la prova
della sua natura
infettiva
• 1882: Robert Koch,
per la prima volta,
isola e coltiva il
Mycobacterium
tubercolosis che da
allora è anche
conosciuto come
bacillo di Koch
Relazioni genetiche ed evolutive tra le
specie di M. tuberculosis complex
Evoluzione per
delezione genica
M. tuberculosis è la specie geneticamente più vicina al ceppo
ancestrale;
Le specie si sono evolute e differenziate seguendo un
processo di delezione di frammenti di genoma;
La specie di M. bovis è quella che ha subito il maggior
numero di delezione;
Tutti i ceppi di BCG presentano la delezione della regione
RD1 di M. tuberculosis complex, che codifica per importanti
fattori di virulenza (Esat-6, CFP10, PPE68, etc.);
Ne consegue che M. bovis si è evoluto a partire dal ceppo
ancestrale di M. tuberculosis, e che pertanto la tubercolosi è
stata trasmessa dall’uomo agli animali e non viceversa.
Si stima (dati OMS) che circa 50
milioni di persone siano infettate
da micobatteri che presentano
farmaco-resistenze
Prevalence of drug resistance among
new cases of tuberculosis
Estonia 1999
China (Henan) 1996
Russia (Ivanovo) 1999
Latvia 1998
Russia (Tomsk) 1999
Thailand 1997
Sierra Leone 1997
0
MDR-TB
20
40
60
Any drug resistant other than MDR
80
100
Susceptible
La soluzione raccomandata dall’OMS
per il problema rappresentato dai
micobatteri “multi drug resistant” è il
protocollo DOTS (Directly Observed
Treatment-Short Course)
Il regime terapeutico DOTS, della durata di
sei mesi, prevede l'impiego simultaneo di
almeno 3 farmaci: l'isoniazide, la rifampicina
e la pirazinamide per i primi 2 mesi,
rifampicina e isoniazide per i restanti 4 mesi.
In particolari casi questi farmaci possono di
volta in volta essere integrati da
streptomicina, etambutolo o etionamide.
• Mycobacteria other than tubercle bacilli
(Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M.
africanum) and M. lepraeare now are
recognized as important human pathogens
• Some of these species can cause serious,
even fatal, diseases in animals and
humans. These microorganisms, once
considered only environmental and
saprophytic species, have been called by
many names: anonymous, opportunistic,
atypical and opportunistic bacilli
•The terms “non-tuberculous
mycobacteria” (NTM) and
“mycobacteria other than
tubercle bacilli” (MOTT) are
preferable
Ecology of Nontuberculous Mycobacterial
(1)
• Many nontuberculous mycobacteria are freeliving saprophytes that have been detected in
and isolated from a wide variety of
environments, including water, soil, dust, and
aerosols.
• In addition to their presence in natural
environments, nontuberculous mycobacteria
have been recovered from drinking-water
distribution systems throughout the world.
Ecology of Nontuberculous Mycobacterial
(2)
• The highest rates of NTM colonization in
potable water systems are found in hospitals
and hemodialysis and dental offices, with
rates ranging from 60% to 100%.
• The
resistance
of
nontuberculous
mycobacteria to disinfection undoubtedly
contributes to the ability of a number of
nontuberculous
mycobacteria
(e.g.,
Mycobacterium
xenopi,
M.
avium,
M.
fortuitum, and M. chelonae) to persist in
drinking-water systems
The Runyon classification and characteristics of clinically
significant nontuberculous mycobacteria (NTM)
Species
(Runyon group)
Ideal
temp. for
growth
Time for
growth,
days
37 °C
10-20
30 °C
5-10
Deep yellow (with light),
smooth to rough
Scotochromogens (II)
M. szulgai
M. xenopi
M. gordonae
37 °C
42 °C
37 °C
10-25
15-30
10-15
Orange, smooth to rough
Yellow and rough
Deep yellow-orange and
smooth
Photochromogen at 25 °C
Occasionally non pigmented
Nonphotochromegens(III)
M. avium
37 °C
10-20
Smooth-transparent flat
colonies tend to be more
Virulent
M. haemophilum
30 °C
15-20
3 variants: smoothopaque raised, smoothtransparent flat, rough
Smooth to rough
Rapid growers (IV)
M. fortuitum
37 °C
3-5
28°C
3-5
Transparent to creamcolored smooth
Transaparent to creamcolored smooth
May grow on 5% sheep
blood agar
May grow on 5% sheep
blood agar
Photochromogens (I)
M. kansasii
M. marinum
M. chelonae
Colony morphology
Yellow (with light)
Comments
Occasional
scotochromogenic
or nonchromogenic strains
Water exposure
Importanza delle infezioni sostenute da MNT
• In Svizzera, dal 1983 al 1988, l’incidenza della
tubercolosi è passata da 16,2 a 13,2 casi per 100.000
abitanti, mentre quella delle micobatteriosi da MNT da
0,4 a 0,9 per 100.000 abitanti (Debrunner M et al., CID,
1992).
• In Inghilterra, nel 1970, veniva isolato 1 MNT ogni 60 M.
tuberculosis, mentre nel 1992 si è passati ad un rapporto
di 1 MNT per 6 M. tuberculosis (Yates, JCM, 1995).
• Infine, in Europa e negli USA è stato riportato che dal
25 al 50% dei pazienti con AIDS è affetto da
micobatteriosi non tubercolari.
Incidence rates (per 100,000 population) of disease
due to nontuberculous mycobacteria in the Northern
Territory of Australia,1989–1997
O’Brien DP, et al.. (2000) CID Vol. 31, 958-967
Association of species of nontuberculous mycobacteria
(NTM) with clinical categories of nosocomial infection
Clinical category
Disseminated infection in
immunocompromised patients
Respiratory tract
colonization/infection
M.
avium
+
Peritonitis associated with CAPD
Injection associated cutaneous
and joint infections
Surgical infections
M.
xenopi
M.
kansasii
M.
gordonae
++
Infections related to hemodialysis
Intravascular catheter infections
Rapid
growers
+
Other
NTM
+
+++
+
++
++
+
++
+
++
+++
+
+
+
+
+
NOTE. CAPD, continuous ambulatory peritoneal dialysis;
+ rarely associated; ++ occasionally associated; +++ frequently associated.
From: Phillips and van Reyn, CID, 2001
Association of species of nontuberculous mycobacteria
(NTM) with types of nosocomial pseudoinfection
Type of pseudoinfection
M.
avium
Rapid
growers
M.
xenopi
Contamination via endoscope or
automated endoscope washer
+
++
+
Contamination in microbiology and
pathology laboratory
+
++
Generalized contamination of a
variety of clinical specimens after
colonization of hospital water
systems
+
M.
gordonae
M.
scrofulaceum
+
+
+
Contamination in specimen
collection
M.
marinum
++
+
+
+
+
NOTE: + rarely associated; ++ occasionally associated; +++ frequently associated.
From: Phillips and van Reyn, CID, 2001
• Sulla base della sequenza
del gene che codifica l’RNA
ribosomale 16S, sono state
identificate più di 100
specie di micobatteri
• According to Wolinsky (1979) the
following information is required for
demonstrating that a particular
nontuberculous mycobacterium was
responsible for disease : the species
of Mycobacterium, the quantity of
growth on primary culture, repeated
isolations of the same organism from
the specimec taken at different
times, and the host’s risk factors
Chemotherapy of Nontuberculous
Mycobacterial Infections (1)
• Chemotherapy of nontuberculous mycobacterial infections
has been problematic because of the relative resistance of
nontuberculous mycobacteria to a wide range of antibiotics.
• Further, because most mycobacteria are intracellular
pathogens, the mammalian host cells (e.g., macrophages) serve
as a barrier to the delivery of drug to the intracellular
environment.
• The relative hydrophobicity of nontuberculous mycobacteria
is thought to restrict the activity of most hydrophilic drugs.
An example is rifabutin, a hydrophobic derivative of rifampin,
which has been shown to be effective in prophylaxis and
treatment of nontuberculous mycobacterial infections
Chemotherapy of Nontuberculous
Mycobacterial Infections (2)
• There are a number of published guidelines for
prophylaxis and treatment of nontuberculous
mycobacterial infections, especially directed
toward M. avium. These include American
Thoracic Society Guidelines on the diagnosis
and treatment of disease caused by
nontuberculous mycobacteria and the reports
of the U.S. Public Health Service Task Force on
Prophylaxis and Therapy for M. avium complex.
“Guidelines” utilizzate per la cura delle infezioni
sostenute dalle più imporanti specie di MNT
SPECIE
M. avium complex
M. kansasii
M. xenopi
M. malmoense
M. marinum
PROTOCOLLO TERAPEUTICO
Rifampicina + isoniazide + etambutolo;
Macrolidi (Claritromicina e/o azitromicina)
+ rifabutina
Rifampicina + isoniazide + etambutolo e/o
streptomicina
Rifampicina + streptomicina;
Rifampicina + isoniazide + etambutolo
Rifampicina + isoniazide + etambutolo;
Rifampicina + etambutolo + amikacina
Minociclina o doxiciclina + trimetoprim;
Rifampicina + etambutolo + amikacina
Falkinham JO. Clin. Microbiol. Rev. 1996
Antimicrobial activity for the three most
frequently isolated species of nonpigmented RGM
Antimicrobial agent
Species
> 90% susceptible or
intermediate (% if <100%)
< 90% susceptible or intermediate (approx.
% susceptibility/intermediate)
M. fortuitum
group
Amikacin, cefoxitin,
ciprofloxacin, moxifloxacin,
gatifloxacin, imipenem,
levofloxacin, linezolid (96%)
Clarithromycin (80%), doxycycline (46%),
vancomycin (38%)
M. abscessus
Amikacin (98%), cefoxitin (95%),
clarithromycin
Ciprofloxacin (<1%), doxycycline (4%),
imipenem (57%), linezolid (48%)
M. chelonae
Amikacin (97%), clarithromycin,
moxifloxacin, gatifloxacin (96%),
linezolid (94%), tobramycin
Ciprofloxacin (19%), doxycycline (26%),
imipenem (40%)
From: Brown-Elliott and Wallace, CMR, 2002
Diagnosis of mycobacterial infections by
conventional procedures
DIRECT
CULTURE
ISOLATION AND
IDENTIFICATION
DRUG-SUSCEPTIBILITY
TESTING
INDIRECT
MICROSCOPIC
EXAMINATION
ANTIBODY
DETECTION ?
Terreni di coltura solidi più comuni per
micobatteri
Terreno
Componenti
Agenti
inibitori
Lowenstein-Jensen
(LJ)
Proteine di uovo coagulate,
Verde malachite
sali, glicerolo, fecola di patate (penicillina,
e RNA
acido nalidixico)
Middlebrook 7H10
Sali, vitamine, cofattori, acido Verde
oleico, albumina, catalasi,
malachite,
glicerolo, destrosio, agar
cicloesimide,
lincomicina,
acido nalidixico
Middlebrook 7H11
Sali, vitamine, cofattori, acido
oleico, albumina, catalasi,
glicerolo, destrosio, agar,
idrolizzato di casteina
Carbenicillina,
amfotericina B,
polimixina B,
trimethoprim
Modalità consigliate per la raccolta dei materiali
patologici per la ricerca di M. tuberculosis e dei
MNT
Materiale
Modalità di raccolta Numero di campioni
Espettorato
Primo mattino* con o
senza nebulizzazione
Uno al giorno per 3/5
giorni
Urine
Primo mattino*
raccolta completa
Uno al giorno per 3/5
giorni
Liquor
Puntura lombare
Uno o più se possibile
Biopsie
Escissioni o incisioni
Lente
Escissioni o tampone
Broncoaspirato
Aspirazione di
secrezioni bronchiali
Succo gastrico
Aspirazione di succo
gastrico al primo
mattino
*Non utilizzare raccolte di 24 ore in quanto fortemente contaminate con flora microbica non specidica
Metodi di digestione, decontaminazione e concentrazione dei
campioni clinici per la ricerca di M. tuberculosis e dei MNT
Metodo
Commento
N-acetil-L-cisteina (NALC) + 2%
di NaOH
Soluzione decontaminante
(NaOH); agente mucolitico
(NALC)
Ditiotreitolo + 2% NaOH
Azione mucolitica più efficace
13% di fosfato trisodico + cloruro Azione antibatterica più blanda
di benzalconio
Cloruro di cetilpiridinio + 2% NaCl Utilizzato per la spedizione dei
campioni
4% di NaOH
Per campioni fortemente
contaminati
4% di acido solforico
Per la decontaminazione dei
campioni di urina
5% acido ossalico
Elimina Pseudomonas aeruginosa
Trattamento dei campioni clinici contenenti
micobatteri
Espettorato od altro campione clinico contaminato
Digestione con sputolisina
Campioni extrapolmonari non sterili
Decontaminazione con NaOH al 2% (conc. finale)
Campioni sterili
Centrifugazione a 1500xg
Risospendere e lavare 2 volte con PBS pH 7.2; risospendere con BSA
priva di acidi grassi (0.2%)
Esame microscopico diretto
(Ziehl-Neelsen, auramina)
Semina in LJ
Semina in terreno liquido
Sistemi di coltura in terreno liquido per
l’isolamento di micobatteri da materiali clinici
Metodi radiometrici
• BACTEC 460 TB
Metodi non radiometrici
• BACTEC 9000 MB
• Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT)
– MGIT 460
– MGIT 960
– MB/BacT System
– ESP Culture System II
Journal of Clinical Microbiology, May 1984,vol. 19:720-1
Recovery and susceptibility testing of
Mycobacterium tuberculosis from
extrapulmonary specimens by the BACTEC
radiometric method
Fadda G1, Roe SL2
Medical Microbiology Department1, University of Sassari, Sassari, Italy
and Becton Dickinson Laboratory Systems2, Mechlin, Belgium
Tecnologia a fluorescenza
Ruthenium
complex
Tecnologia a fluorescenza
Coltura Positiva
Coltura Negativa
O2
O2
O2 CO2
O2 O O2
2
CO2
O2
O2
CO2 O2
FO2 FO2FO2
FO2 F
F FO
FO2F 2FO2
Poca o nessuna fluorescenza
Spazio vuoto
O2
O2
Brodo
O2
Sensore
O2
O2
CO2
F F F F
FO2 F
F F FO2 F
Forte fluorescenza
BACTEC 9000MB
™
Monitoraggio
continuo in
fluorescenza, non invasivo
Risultati
significativamente più
veloci rispetto ai terreni
solidi
Flacone Myco/F Sputa per
tutti i campioni
Flacone specifico per il
sangue Myco/F Lytic
2000 campioni/anno (2040 settimana)
Curve, referti di
positività
Journal of Clinical Microbiology, 1997, 35(8):2072-5
Evaluation of a nonradiometric system (BACTEC
9000 MB) for detection of mycobacteria in
human clinical samples
Zanetti S2, F. Ardito1, L. Sechi2, M. Sanguinetti1, P. Molicotti2, G. Delogu2, M.
P. Pinna2, A. Nacci1, and G. Fadda1
Istituto di Microbiologia1, Universita’ Cattolica del S. Cuore, Rome and Dipartimento di
Scienze Biomediche, Sezione di Microbiologia Sperimentale e Clinica2, Universita’ degli
Studi di Sassari, Italy
MGIT 460
Risultati
rapidi
Utilizzo semplice
Non invasivo e non
radiometrico
Per laboratori con 120 campioni/settimana
Disponibile AST
New Microbiologica, 2000, 23 (2): 151-158
Comparison of the Mycobacteria Growth
Indicator Tube (MGIT) with radiometric and
solid culture for isolation of Mycobacteria from
clinical specimens and susceptibility testing of
Mycobacterium tuberculosis
Ardito F.1, M. Sanguinetti 1, L. Sechi 2, B. Posteraro 1, L.
Masucci 1, G. Fadda 1 and Stefania Zanetti 2
Istituto di Microbiologia1, Universita’ Cattolica del S. Cuore, Rome, Centro
Cardiologico "Monzino" IRCCS2, Milan and Istituto di Microbiologia C. A. Romanzi,
Università di Genova, Genoa, Italy3
BACTEC™ MGIT™ 960
strumento a monitoraggio continuo
• Crescita ed Isolamento
Antibiogramma in completa
automazione (2000)
• Utilizza la tecnologia BBL® MGIT™
già esistente
• Sicurezza
Non utilizzo di aghi
provette in plastica
• Per laboratori che processano un
elevato numero di campioni
– fino 8000 colture/anno
Hanna, B. A. et al. 1999. Multicenter evaluation of the BACTEC 960 System for
recovery of mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 37: 782-784.
Tortoli E. et al. 1999 Use of BACTEC MGIT 960 for recovery of mycobacteria from
clinical specimens: multicenter study. J. Clin. Microbiol. 37: 3578-3582.
LA TECNOLOGIA COLORIMETRICA (MB/BacT)
•La chimica della crescita
microbica
– La crescita degli organismi in
un brodo di coltura produce
una variazione in CO2
– La CO2 abbassa il pH
– Il sensore diventa giallo
•Il sensore del flacone
– Sensore colorimetrico
impregnato di silicone
– Sensibile ai cambiamenti in
CO2
– Cambio di colore permanente
• giallo = Positivo
Metodi fenotipici di identificazione dei
micobatteri
– Caratterizzazione del pattern biochimico
– Analisi degli acidi micolici della parete
micobatterica mediante HPLC e gascromatografia
Pattern degli acidi micolici in HPLC di alcune specie
micobatteriche
A: Mycobacterium asiaticum
B: M. bovis
C: M. gastri
D: M. gordonae
E: M. kansasii
F M. leprae
Da: Butler WR, CMR, 2001
Metodi per la determinazione della sensibilità ai
farmaci di M. tuberculosis
• Metodo proporzionale (MOP) (metodo di riferimento)
• Metodo radiometrico (BACTEC 460 TB)
• Metodo MGIT (Mycobacterium Growth Indicator
Tube)
• E-test (sia M. tuberculosis che NTM)
BBL MGIT
®
™
•
•
4 ml AST
La procedura prevede
l’utilizzo di 5 provette
MGIT.
Le provette contengono
quantità standardizzata di
antibiotico:
STR 0.8 mg/mL
INH 0.1 mg/mL
RIF
1.0 mg/mL
ETH 3.5 mg/mL
Controllo di Crescita (GC)
New Microbiologica, 2000, 23 (2): 151-158
Comparison of the Mycobacteria Growth
Indicator Tube (MGIT) with radiometric and
solid culture for isolation of Mycobacteria from
clinical specimens and susceptibility testing of
Mycobacterium tuberculosis
Ardito F.1, M. Sanguinetti 1, L. Sechi 2, B. Posteraro 1, L.
Masucci 1, G. Fadda 1 and Stefania Zanetti 2
Istituto di Microbiologia1, Universita’ Cattolica del S. Cuore, Rome, Centro
Cardiologico "Monzino" IRCCS2, Milan and Istituto di Microbiologia C. A. Romanzi,
Università di Genova, Genoa, Italy3
Antibiogramma automatico SIRE
1. Inoculo
SIRE
3. Scaricamento set
AST
2. Inserimento
Strumento
4. Stampa
risultati
Ardito, Zanetti, Fadda et al. J. Clin. Microbiol., 2001; Bemer et al.,. J. Clin. Microbiol., 2002
Journal of Clinical Microbiology, December 2001,vol. 39: 4440-4444
Evaluation of the BACTEC Mycobacteria Growth
Indicator Tube (MGIT 960) automated system
for drug susceptibility testing of Mycobacterium
tuberculosis
Fausta Ardito1, Brunella Posteraro1, Maurizio
Sanguinetti1, Stefania Zanetti2, and Giovanni Fadda1
Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Rome1, and
Dipartimento di Scienze Biomediche, Sezione di Microbiologia, Università di Sassari,
Sassari2, Italy
Principali sequenze geniche utilizzate per
l’identificazione di MNT
• Gene che codifica la heat shock protein da 65
kDa (hsp65)
• Gene che codifica la subunità b dell’RNA
polimerasi (rpoB)
• Gene che codifica l’RNA ribosomale 16S e
sequenze intergeniche 16S-23S (ITS)
• Sequenze ripetitive disperse nel genoma
Gene che codifica l’RNA ribosomale 16S
• E’ la sequenza genica che meglio riflette le relazioni
filogenetiche tra i batteri, a causa di un tasso di
mutazione basso e costante nel tempo, tanto che può
essere considerata un “orologio molecolare”.
• Per questo motivo la variabilità interspecifica è
piuttosto bassa (per i micobatteri varia dal 94.3 al
100%).
• D’altro canto la variabilità intraspecifica è praticamente
nulla, a differenza del gene hsp65 e rpoB.
• Nell’ambito del gene sono state individuate (Kirschner et
al., JCM, 1993; Rogal et al., JGM, 1990) due regioni
ipervariabili, A (da 129 a 267 bp) e B (da 430 a 500 bp),
la cui analisi consente una valida identificazione delle
varie specie di micobatterio.
Journal of Clinical Microbiology, June 1998, p.1530-1533
Routine Use of PCR-Reverse Cross-Blot
Hybridization Assay for Rapid Identification of
Mycobacterium Species Growing in Liquid Media
M. SANGUINETTI1, B. POSTERARO1, F. ARDITO1, S. ZANETTI2, A.
CINGOLANI3, L. SECHI2, A. DE LUCA3, L. ORTONA3, AND GIOVANNI
FADDA1
Istituto di Microbiologia1 and Clinica delle Malattie Infettive3, Universita’ Cattolica
del S. Cuore, Rome and Dipartimento di Scienze Biomediche, Sezione di Microbiologia
Sperimentale e Clinica2, Universita’ degli Studi di Sassari, Italy
PCR-Reverse Cross Blot Hybridization
dTTP-tailing and fixing of species-specific Biotine
oligonucleotide probes (1-7)
to nylon membrane
1
2
3
Incubation with
streptavidin-AP
and a color substrate
4
5
6
7
PCR with pMyc 14 (5’ biotinilated)
and pMyc7 as primers
Target DNA
Hybridization of biotinilated PCR-product
to oligonucleotide probes
on nylon membrane
1
2
3
4
5
6
Detection of DNA-DNA hybrids by
colored precipitate
7
Analysis by reverse cross-blot hybridization of PCR
products from 13 mycobacterial species
1:Mycobacterium tuberculosis, 2: M. avium, 3: M. intracellulare, 4: M. fortuitum, 5: M. gordonae, 6: M. xenopi,
7: M. chelonae, 8: M. genavense, 9: M. kansasii, 10: M. malmoense, 11: M. marinum, 12: M. smegmatis, 13: M. terrae
Sanguinetti M., Fadda G., et al. JCM, 1998, 36:1530-3
Journal of Clinical Microbiology, September 2002,vol. 40: 3499-3501
Early detection of negative BACTEC MGIT 960
cultures by PCR-reverse cross blot hybridization
assay
L. Romano1, M. Sanguinetti1, B. Posteraro1, F. Ardito1, G.
Gesu2, A. M. Schito3, and G. Fadda1
Istituto di Microbiologia1, Universita’ Cattolica del S. Cuore, Rome, Centro
Cardiologico "Monzino" IRCCS2, Milan and Istituto di Microbiologia C. A. Romanzi,
Università di Genova, Genoa, Italy3
PCR-reverse cross blot hybridization as early negative
predictor for BACTEC MGIT 960 liquid cultures
Time
0
7days
42days
SET A
549 clinical samples
Inoculation in MGIT 960
SET B
Inoculation in MGIT 960
1 ml aliquot was taken
and analyzed by
PCR-reverse cross hybridization
Endpoint
Endpoint
Da: Romano, Fadda et al. J. Clin. Microbiol., 2002
Comparison of results between MGIT 960 and
PCR-reverse cross blot hybridization
Clinical specimens
Specimens
positive by
MGIT (65)
Specimens
negative by
MGIT (484)
Sensitivity
(%)
Specificity
(%)
PPV
(%)
NPV
(%)
PCR
pos
PCR
neg
PCR
pos
PCR
neg
Total (549)
64
1
0
484
98.4
100
100
Respiratory (446)
58
0
0
388
100
100
100
100
6
1
0
96
85.7
100
100
98.9
Non-respiratory
(103)
99.8
PPV: Positive predictive value
NPV: Negative predictive value
From: Romano, Fadda et al. J. Clin. Microbiol., 2002
Br. J. Dermatology, 139, 872-876, 1998
POLYMERASE CHAIN REACTION-REVERSE
CROSS-BLOT HYBRIDIZATION ASSAY IN
THE DIAGNOSIS OF SPOROTRICHOID
MYCOBACTERIUM MARINUM INFECTION
POSTERARO B.1, SANGUINETTI M.1, GARCOVICH A.2, ARDITO F.1,
ZAMPETTI A.2, MASUCCI L.1, SBORDONI G.2, CERIMELE D.2,
FADDA G.1
1Istituto
di Microbiologia, e 2Clinica Dermotologica Università Cattolica del S.
Cuore, Roma, Italia
Nodular lesions on the patient's
right dorsal hand
Histological section of the skin biopsy
Demonstrating dermal inflammation
in a perivascular distribution, with
tuberculoid granulomas showing a
predominance of giant cells
From: Posteraro, Fadda et al., Br. J. Dermatol, 1998
Identificazione molecolare di M. marinum
From: Posteraro, Fadda et al., Br. J. Dermatol, 1998
Utilità della PCR-Reverse Cross Blot Hybridization
per l’identificazione di rare o nuove specie di micobatteri
Clonaggio e sequenza del
frammento di rDNA 16S
amplificato
Campione clinico PCR-reverse
o ceppo in esame hybridization
Sonda genere
specifica
Identificazione e
disegno di una nuova
hybridization
sonda specie-specifica
PCR-reverse
Sonda specie
specifica
Sonda genere
specifica
Confronto con le sequenze
di rDNA del GenBank
Identificazione di Mycobacterium triplex mediante
PCR-Reverse Cross Blot Hybridization
Campione clinico
(liquido sinoviale)
PCR-reverse
hybridization
M. avium
M. chelonae
M. fortuitum
M. genavense
M. gordonae
M. intracell.
M. kansasii
M. malmoense
PCR-reverse
M. marinum
M. smegmatis
hybridization
M. triplex
M. tuberculosis
M. xenopi
Mycobacterium spp
M. avium
M. chelonae
M. fortuitum
M. genavense
M. gordonae
Clonaggio e sequenza del
M. intracell.
M. kansasii
frammento di rDNA 16S
M. malmoense
amplificato
M. marinum
M. smegmatis
M. terrae
M. tuberculosis
M. xenopi
Mycobacterium spp
Completa omologia con
l’rDNA 16S di M.
triplex e disegno di
una sonda speciespecifica
Confronto
con le sequenze
di rDNA del
GenBank
Cingolani, Fadda et al, CID (2000), 31 (1): 177-9
Metodi molecolari utilizzati per la rivelazione
della resistenze in M. tuberculosis
• Tecniche basate sull’elettroforesi
– PCR-SSCP(Single Strand Conformational Polymorphisms)
– Analisi degli heteroduplex (DG-DGGE, RNA/RNA mismatch
assay)
• PCR-DNA sequencing
• Tecniche basate sull’ibridazione
– Ibridazione in fase solida (Inno LiPA Rif. TB)
– Ibridazione in micropiastra
– Ibridazione su array
• PCR “real-time”
– TaqMan probe
– Molecular beacons
– FRET probes
Molecular Epidemiology
Sechi LA, Leori G, Lollai SA, Dupre I, Molicotti P, Fadda G,
Zanetti S.
Different strategies for molecular differentiation of
Mycobacterium bovis strains isolated in Sardinia, Italy.
Appl Environ Microbiol. 1999 Apr;65(4):1781-5.
Sechi LA, Zanetti S, Dupre I, Aceti A, Sanguinetti M, Fadda G.
Genotypic changes in DNA fingerprinting patterns of
Mycobacterium tuberculosis strains from HIV-positive persons in
Sardinia.
AIDS. 1998 Oct 22;12(15):2084-6.
Cingolani A, Antinori A, Sanguinetti M, Gillini, De Luca A,
Posteraro B, Ardito F, Fadda G, Ortona L. Application of
molecular methods for detection and transmission analysis of
mycobacterium tuberculosis drug resistance in patients attending a
reference hospital in Italy.
J Infect Dis. 1999 Apr;179(4):1025-9.
Sechi LA, Zanetti S, Delogu G, Montinaro B, Sanna A, Fadda G.
Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis strains
isolated from different regions of Italy and Pakistan.
J Clin Microbiol. 1996 Jul;34(7):1825-8.
DNA Fingerprinting
Journal of Clinical Microbiology, Apr. 1993, p 767-770
The Resurgence of Tuberculosis: Is Your
Laboratory Ready?
FRED C. TENOVER, JACK T. CRAWFORD, ROBIN E. HUEBNER, LARRY J. GEITTER, C. ROBERT
HORSBURGH. JR., AND ROBERT C. GOOD
CDC Atlanta
•RECOMMENDATIONS
• Promote the rapid delivery of specimens to the laboratory on a day basis (24h).
• Inoculate a liquid medium as primary culture, and include inoculation of a slant of LJ medium.
• Identify growth in liquid medium as acid fast and use probes, NAP, mycolic acid patterns or other
molecular tests, i. e. PCR reverse hybridization, to identify as M. tuberculosis or MOTT as soon as
possible.
• Determine the susceptibilities of M. tuberculosis isolates to primary drugs in a BACTEC or similar
systems (MGIT).
• Maintain up-to-date records
• Review all laboratory procedures and facilities to garantee safety of workers.
• Acid fast examinations of specimens in 24h (Use a fluorescent acid-fast staining)
• Identifications of M. tuberculosis within 10-14 days
• Reports of drugs susceptibility test within 15-30 days
Università Cattolica
del S. Cuore - Roma
• Istituto di Microbiologia
– G. Fadda
– F. Ardito
– G. Delogu
– B. Posteraro
– M. Sanguinetti
– L. Romano
Università di Sassari
• Istituto di Microbiologia
e Virologia
– S. Zanetti
– L. Sechi
– P. Molicotti