Comments
Description
Transcript
fattori di trascrizione
COME RICONOSCERE UNA SEQUENZA REGOLATORIA DI CIRCA 10 NUCLEOTIDI FRA I 3000000000 CHE COMPONGONO IL GENOMA UMANO? LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi FATTORI DI TRASCRIZIONE • FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter” • REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Basal factor binding sites Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE • Il legame promotore RNA polimerasi richiede i fattori di trascrizione generali Promotori ~200 bp gene COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE ATTIVITA’ Reporter gene 100% eg CAT, luciferase Reporter gene 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0% COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE ATTIVITA’ Reporter gene 100% eg CAT, luciferase Reporter gene 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Livello di trascrizione attivato basale represso Elementi del Core promoter • siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici Transcribed region RNAP II BRE TATA-box TATA ~24bp Inr DPE 8 bp elemento ricco in AT Bound by TFIID BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID TFIIF TFIIE 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA 2-3 subunits TFIIB 1 subunit ~40 polipeptidi TFIID 12 subunits 10 subunits TFIIH 9 subunits RNAP II BRE TATA TATA-box 8 bp AT BRE 6 bp Inr ~24bp Inr lega TFIID lega TFIIB DPE lega TFIID DPE QuickTime™ and a YUV420 codec decompressor are needed to see this picture. QuickTime™ and a Sorenson Video decompressor are needed to see this picture. Q ui ck Ti m e ™ an d a V id eo M PE G- 4 d ec om pr es so r a re ne ed ed t o s ee th i s pi c tu r e. TFIIF TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24bp TFIIE Inr DPE RNAP II QuickTime™ and a None decompressor are needed to see this picture. TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors —TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina TFIID BRE TATA ~24bp Inr DPE TFIIA TFIIA BRE TFIID TATA ~24bp Inr DPE -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF TFIIB TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24bp Inr DPE -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione TFIIF TFIIF TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24bp Inr DPE RNAP II Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA TFIIE TFIIF TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24bp Inr DPE RNAP II TFIIE Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH TFIIH TFIIF TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24bp Inr DPE RNAP II TFIIE Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione QuickTime™ and a None decompressor are needed to see this picture. — REGOLATORI GENE SPECIFICI Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE Regolatori gene specifici • hanno una struttura modulare • contengono un dominio che lega il DNA • contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale • qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione • qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione (MADS box) N Donatore H H O C Accettore A D A A A M A A A D D A M A A D A A D A A D A A Regolatori gene specifici 1) Contengono un dominio che lega il DNA 2) E un dominio di attivazione trascrizionale Transcribed region Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi? DNA loop Enhancers- stimolano la trascrizione 1. Attivatori si legano ad un sito specifico 2. Il DNA si ripiega Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione Controllo combinatoriale dell’espressione genica Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti Heterodimerization of DNA binding proteins can alter their sequence specificity Enhancer e Repressori promotore enhancer repressore 10-50,000 bp RNAP gene enhancer interagiscono con RNAP trascrizione repressore previene il legame dell’enhancer Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche • Cambio dell’attivita’ • Cambio della localizzazione cellulare Recettori nucleari Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali TAF TBP RNA pol II TAF TAF TAF RGRACANNNTGTYCY Nuclear Receptors Legame dell’ormone Dissociazione da hsp90 GR GR GR GR hsp90 hsp90 dimerizzazione GR GR Migrazione nel nucleo Legame al DNA TATA Regolazione mediante fosforilazione • Ormoni attivano una chinasi • La chinasi fosforila un fattore di trascrizione • Il fattore e’ attivato Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase) MEKK P SEK MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase P P JNK P SEK fosforila JNK – una MAP kinase Cascata delle chinasi JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 nucleo P AP-1 attiva la trascrizione legandosi a – TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali RNA pol II JNK P P C-JUN C-FOS TRE QuickTime™ and a None decompressor are needed to see this picture. Metilazione del DNA • La citosina puo’ essere metilata: • Risulta in una maggiore condensazione della cromatina • La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X Trascrizione e struttura della cromatina • Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile • La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente • La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni Acetilazione degli Istoni • E’ una modificazione post-traduzionale • Gruppi acetilici (CH3COO–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive • Eliminano le interazioni ioniche con il DNA • Diminuiscono la condensazione • Associati con una attiva trascrizione – Acetilazione/Deacetilazione QuickTime™ and a YUV420 codec decompressor are needed to see this picture. Attivatori: acetilazione degli Istoni • Alcuni attivatori attirano delle acetilasi • Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato Alcune Istone Acetilasi (HAT) • • • • p300/CBP TAF II 250 Ambedue sono dei co-attivatori SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP Repressori: deacetilazione degli Istoni • Alcuni repressori attirano delle deacetilasi • Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA – Acetilazione/Deacetilazione SWI/SNF in Lievito SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio). Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA Macchinari di Rimodellamento • Tutti contengono subunita’ simili a swi2/snf • NTP-binding proteins http://www.uniroma2.it/didattica/bioc himica/deposito/ Lez8-10.ppt Lez15-10.ppt Lez22-10.ppt Lez29-10.ppt (ancora da aggiungere) Regolazione dell’Espressione Genica Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi: NUCLEUS CYTOSOL inactive mRNA degradazione DNA RNA transcript trascrizione mRNA Maturazione mRNA trasporto traduzione protein controllo dell’attivita’ inactive protein Controllo della Traduzione 1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina 2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina Ferritina - Lega il Ferro e lo conserva Recettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFR Se non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina Come viene regolato tutto questo? 1. Repressione :-Ferro, ferritina NO IRE-BP (cytosolic aconitase) M Ferritin mRNA M AUG m7G Coding region Iron Response Element 2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI Fe Fe Fe M AUG Coding region 1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI IRE-BP (cytosolic aconitase) M m7G AUG Iron Response Element TFR mRNA Coding region 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO Fe Fe AUG Coding region 1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI IRE-BP (cytosolic aconitase) m7G AUG Iron Response Element TFR mRNA Coding region 2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO Fe RNAse AUG Coding region Controllo dello Splicing: espressione di Fibronectine tessuto-specifiche Figure 11-24 Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene • Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’ • Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili • Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici Trasporto segnale-mediato attraverso il poro nucleare (NPC) The nuclear pore complex Figure 11-28 La proteina HIV Rev regola il trasporto dell’RNA virale non ancora maturo Figure 11-38 L’RNA Editing altera le sequenze dei premRNA Figure 11-39 • mRNA editing Nel fegato La deaminasi e’ presente solo nell’intestino Nell’intestino No Aminoacidi No tRNA amino-acetilati Gcn2p kinase P S51 GDP GDP a eIF2 eIF2 eIF2B GTP Translation competent eIF2