Diapositiva 1 - Cell Factory Mantova

Tissue engineering: formazione di
lembi di cartilagine e cute,
utilizzando cellule staminali
adulte e loro applicazioni cliniche.
Borgo Roma – 12/12/05
I parte
concetti generali
Uno dei maggiori obiettivi della medicina moderna è
quello di ripristinare tessuti e/o organi danneggiati da
malattie o traumi.
Nel XX secolo i trapianti di tessuti (osso, muscolo e cute)
e di organi (rene, fegato, polmone) sono stati introdotti
con successo nella pratica terapeutica grazie all’impiego
di tecniche di anastomosi microvascolari e di idonea
terapia immunosoppressiva. Nonostante ciò, molti sono i
problemi legati al trapianto di organi, tra i quali i più
significativi sono:
scarsa disponibilità di tessuti e d’organi idonei al trapianto e
conseguenti lunghi tempi di attesa,
necessità di sottoporre il Paziente a terapia immunosoppressiva per tutta la vita con conseguenti deficit
immunitari,
rischio di tromboembolia nel caso in cui vengano utilizzati
materiali sintetici (ad esempio per le valvole cardiache) e di
emorragie conseguenti al trattamento anticoagulante,
necessità di sottoporre il paziente a più trapianti (ad esempio
per rigetto tardivo o utilizzo in pazienti giovani di materiale
sintetico non in grado di adeguarsi alla crescita corporea).
Ingegneria Tessutale
L’ingegneria tessutale è un’ area multidisciplinare di
ricerca che ha come scopo la rigenerazione di
tessuti ed organi danneggiati del nostro organismo,
partendo dal presupposto che la quasi totalità delle
cellule animali possono essere coltivate in
laboratorio.
Il principio generale è quello di prelevare cellule
staminali dallo stesso paziente bisognoso di
trapianto, farle crescere e differenziare su un
supporto idoneo in modo da produrre il tessuto che
deve essere sostituito.
E’ molto importante che:
venga prodotta una quantità di cellule e di
tessuto sufficiente per riparare il difetto,
venga garantita una giusta differenziazione
cellulare in modo da mantenere un corretto
fenotipo,
venga riprodotta una struttura tridimensionale
identica al tessuto o organo da sostituire per
garantire una corretta vascolarizzazione.
II parte
concetti generali
Cellule staminali
sono distinte in:
totipotenti: potenzialmente capaci di originare
qualsiasi tipo di tessuto. Possono creare un
organismo completo.
pluripotenti (multipotenti): possono sviluppare
una vasta gamma di tessuti ( ad esempio le cellule
progenitrici della linea ematopoietica), ma non
sono in grado di sviluppare un organismo
completo.
unipotenti: sviluppano una sola linea cellulare.
Le cellule adibite alle colture
possono provenire da prelievi:
autologhi: le cellule vengono prelevate
dallo stesso Paziente che necessita del
trapianto;
omologhi: le cellule vengono prelevate da
un individuo della stessa specie (vivente o
cadavere);
eterologhi: le cellule sono prelevate da un
donatore di specie diversa dal ricevente,
per esempio il maiale per l’uomo.
Le cellule che possono essere impiegate per la
rigenerazione e riparazione tessutale possono
provenire da:
1- cellule staminali embrionali: si tratta di
cellule totipotenti. La loro estrazione richiede la
soppressione dell’embrione, che non supera mai i
14 giorni dalla sua fecondazione.
Vengono distinte:
Staminali embrionali
a- eterologhe: stadio di blastocisti – V giornata
prima dell’impianto in utero; (embrioni sovrannumerari rimasti inutilizzati nelle cliniche per la
fertilità)
b- autologhe: sono prelevate dopo che il nucleo
di una cellula adulta viene trasferito in un uovo
privato del suo nucleo. Possiedono lo stesso
patrimonio genetico del donatore della cellula
adulta e possono essere trapiantate senza rischi di
rigetto (clonazione terapeutica)
Staminali fetali
dall’ottava settimana al parto
sono cellule tendenzialmente pluripotenti.
derivano per più da materiale autoptico.
Poco studiate.
Staminali da cordone ombelicale
possono essere sia autologhe che omologhe
scarse complicanze immunologiche
poco numerose
applicazioni sembrano ristrette solo alla produzione di
cellule emopoietiche.
Staminali adulte
provvedono al mantenimento dei tessuti e alla
loro riparazione
Possono essere:
multipotenti :




le piu’ studiate sono nel midollo osseo
CD34+
emopoietiche
cellule mesenchimali {osteoblasti, condrociti,
adipociti}
Staminali adulte
unipotenti o mature:
sviluppano una sola linea cellulare (cellule
differenziate),
basso indice proliferativo
oggetto delle mie ricerche (cheratinociti,
condrociti e fibroblasti).
Facilmente disponibili
Storia del donatore
Non problemi etici
Sorgente rinnovabile
Autotrapianti
Plasticità
è
la capacità di una cellula staminale di produrre cellule
figlie che esprimono diversi fenotipi maturi. La plasticità
consente ad una cellula staminale impiantata in tessuti
già differenziati, di dare origine a tipi cellulari non
presenti nel tessuto di origine della cellula staminale
stessa. Così, ad esempio, una cellula staminale del
midollo osseo può dare origine ad una cellula epatica,
cardiaca
o
nervosa.
Questa
capacità
(detta
transdifferenziazione) è strettamente dipendente dalle
influenze del microambiente in cui la cellula staminale si
trova a crescere.
III parte
coltura di condrociti
Istologia - cartilagine
Condrociti
Fibre
Sostanza intercell.
Sostanza amorfa
Istologia
Esistono tre tipi di cartilagine:
ialina,
elastica,
fibrosa.
Tutti i tre tipi sono costituiti da condrociti
da matrice extra-cellulare
Cartilagine ialina
E’
caratterizzata
da
fibre
collagene
prevalentemente di tipo II che formano un
delicato reticolo immerse in un’abbondante
matrice amorfa o sostanza fondamentale
ricca in complessi proteico – mucopolisaccaridici.
Istologia
A. Pas (40x)
I condrociti sono accolti in spazi scavati
detti lacune
Le lacune si condensano a formare le
“capsule”
Istologia
Ematosilina (10x)
Le cellule figlie
formano un clone di
elementi accostati tra
loro
Tali cloni sono
denominati gruppi
isogeni
Cartilagine fibrosa
E’ caratterizzata dalla presenza di grossi
fasci fibrosi di collagene in una scarsa
matrice
la cartilagine fibrosa è una forma di
transizione tra il tessuto connettivo denso
o compatto e la cartilagine
Cartilagine elastica
La cartilagine elastica presente ad esempio nel
padiglione auricolare e nel naso è caratterizzata
dalla presenza di fibre di elastina e da scarsa
sostanza amorfa nella matrice extracellulare.
Cartilagine ialina
La principale funzione della
cartilagine ialina è quella di
facilitare lo scorrimento delle
superfici articolari e di trasferire il peso al sottostante osso.
Quando
danneggiata,
la
cartilagine presenta scarsa capacità rigenerativa a causa
dell’assenza di vascolarizzazione e di innervazione
Danni cartilaginei
della sola matrice
difetto parziale
difetto a tutto spessore
Il naturale processo di riparazione porta alla
formazione di tessuto fibro-cartilagineo che
non presenta le caratteristiche di resistenza e
deformabilità al carico tipiche della cartilagine
ialina e che sono dovute alla sua particolare
composizione biochimica
Nonostante numerosi protocolli terapeutici
siano stati proposti ed applicati, i risultati
soprattutto a lungo termite sono risultati
insoddisfacenti.
–due obiettivi
Il primo è quello di aumentare il numero di cellule per
raggiungere la quantità necessaria per riparare il difetto
cartilagineo.
Il secondo è quello di ottenere il fenotipo corretto
TRAMITE
Cellule in sospensione
Cellule seminate su supporto
La presenza di una
lesione cartilaginea viene
normal-mente riscontrata
durante un esame artroscopico.
Durante tale esame, si
può procedere ad un
prelievo di una piccola
quantità di cartilagine
sana in una zona non di
carico.
La biopsia viene quindi inviata al
laboratorio di colture cellulari, dove i
condrociti si moltiplicano in accurate
condizioni di asepsi. Dopo circa 3 – 4
settimane le cellule sono in numero
sufficiente per essere re-impiantate;
trattandosi di cellule autologhe, non vi
sono rischi di infezioni o di reazioni di
rigetto.
A questo punto si procede alla
seconda parte dell’intervento:
si incide l’articolazione, si
raschiano i bordi e si pulisce il
letto della lesione, rimuovendo
la cartilagine danneggiata così
da rendere l’area atta a
ricevere le cellule coltivate
Una piccola incisione viene
eseguita
sulla
tibia
per
prelevare un lembo di periostio
che ricopre la parte anteriore e
mediale della superficie ossea.
Il lembo viene quindi suturato
sopra la lesione ed il
ricettacolo così creato potrà
ricevere i condrociti coltivati.
Le cellule aderendo all’osso
sottostante, rigenereranno gradualmente un nuovo tessuto
cartilagineo che nel tempo
assumerà caratteristiche simili
alla cartilagine originaria.
Tuttavia, dopo i primi risultati incoraggianti
tale procedura ha mostrato dei difetti:
metodica invasiva
risultati non sempre soddisfacenti (Breinan
– 1997).
Uso di supporti - scaffolds
L’impiego di componenti cellulari supportati da scaffolds adeguati,
potrebbe condurre a risultati positivi nella riparazione del tessuto
articolare, consentendo un miglioramento della tecnica chirurgica.
L’impiego di scaffolds consente infatti:
di migliorare l’attecchimento, la riproduzione e la differenziazione
cellulare,
di trattenere “fisicamente” le cellule nella zona da riparare.
devono possedere le seguenti caratteristiche:
tollerabilità: devono essere immunologicamente
inerti,
impalcatura provvisoria: dopo integrazione il
biomateriale deve essere sostituito dal tessuto
originario,
contenuto informativo: devono comunicare e
scambiare segnali con le cellule ospite.
Le matrici più idonee
per la crescita di condrociti e di cheratinociti
autologhi, sono di tipo naturale e sono
collagene e derivati
fibrina anche autologa
acido ialuronico
cellulosa
Grande interesse viene rivolto al collagene; questa
molecola si è dimostrata in grado di ricostruire un
epitelio
con caratteristiche
morfo-funzionali
nettamente superiori rispetto alle altre matrici.
Isolare
i
condrociti
umani
autologhi per la ricostruzione
della cartilagine articolare su
supporto di collagene
Isolamento dei condrociti
Asportazione di cartilagine dal condilo
femorale di un Paziente di sesso maschile
di anni 63
Frammenti di cartilagine trattati con tre
enzimi ( ialuronidasi, pronasi, collagenasi)
per togliere la matrice extracellulare
Risultati
L’estrazione dei condrociti ottenuta nel
nostro
esperimento
da
frammenti
di
cartilagine ha permesso di ottenere 2
milioni
di
cellule,
seminate in seguito in
fiasca F 75
Microscopio a contrasto di
fase
Condrociti dopo 48 ore - 20 x
40 x
40 x
Coltura primaria di condrociti prima
settimana - 10 x
Coltura primaria di condrociti prima
settimana - 20 x
Coltura primaria in subconfluenza inizio
della seconda settimana - 20 x
Coltura primaria in subconfluenza inizio
della seconda settimana - 40 x
Coltura primaria in confluenza alla fine
della seconda settimana
Tripsinizzazione dalla fiasca e
risemina su supporto
III settimana - inizio
Ematossilina - eosina - 10 x
ICH - vimentina
ICH - vimentina
III settimana - inizio
Ematossilina - eosina - 20 x
III settimana - inizio
Ematossilina - eosina - 40 x
III settimana - fine
Ematossilina - eosina - 20 x
IV settimana - inizio
Ematossilina eosina - 10 x
IV settimana - inizio
Ematossilina eosina - 20 x
IV settimana - fine
Ematossilina eosina - 20 x
IV settimana - inizio
Ematossilina eosina - 40 x
IV settimana - istochimica
Alcian PAS - 40 x
IV settimana - istochimica
Alcian PAS - 40 x
ICH: collagene II
Marker caratteristico
della cartilagine ialina
Abbiamo verificato la possibilità di crescita con
corretta differenziazione dei condrociti su
biomateriali (spugnette di collagene di tipo I)
questi possono essere utilizzati per reimpianto
nella sede lesionata