Presentazione di PowerPoint - Dipartimento di Farmacia

Analisi di proteine:
Elettroforesi e Western Blot
Seminario Metodologico per
il Corso di Didattica Libera
Marilena Dinardo
[email protected]
Le proteine sono il prodotto dei geni: sono le
proteine che servono a “fabbricare” un
organismo, a farlo funzionare e, quando sono
difettose, si rendono responsabili di malattie.
Ed è proprio attraverso lo studio del
funzionamento delle proteine che si potrebbe
arrivare alla costruzione di nuovi farmaci….
Purificazione delle
proteine:
La purificazione di una proteina
costituisce il primo passaggio nello
studio delle sue proprietà.
Una proteina, per poter essere
purificata, deve dapprima essere
estratta dalla sua matrice biologica e
poi allontanata selettivamente dalle
altre proteine.
La procedura adottata per ottenere
un estratto grezzo (estratto contenente
tutte le proteine cellulari solubili nel
tampone di estrazione utilizzato)
dipende dalla localizzazione cellulare
della proteina di interesse.
La rottura delle cellule
può essere ottenuta
mediante:
Digestione enzimatica della parete o della membrana
plasmatica mediante appropriate miscele di cellulasi, lipasi
e proteasi (tripsina, collagenasi, ialuronidasi);
Shock osmotico;
Successivi cicli di congelamento/scongelamento;
Generalmente devono però essere applicati
metodi più energici, che sottopongono le cellule a
stress meccanici. I metodi di rottura meccanici
sono fondamentalmente di due tipi:
mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido;
mediante forze frizionali in sospensione di cellule.
Gli omogeneizzatori sono costituiti da un tubo di vetro e da un pestello
mosso a mano (Dounce o Tenbrock) o elettronicamente (PotterElvejham).
Il tubo è mantenuto fisso mentre il pestello viene fatto ruotare per generare
le forze frizionali, le quali sono più elevate alla superficie del pestello e
minime lungo la parete del tubo. Lo spazio libero tra il pestello e la
parete del tubo è mantenuta entro dimensioni precise in quanto l’attrito
sviluppato dipende dal raggio del pestello e del tubo di vetro e dalla
velocità di rotazione del pestello stesso.
Le procedure utilizzate per ottenere un
estratto
proteico
grezzo
sono
estremamente semplici e richiedono:
- la rottura delle cellule in uno
specifico buffer;
- la centrifugazione del campione per
rimuovere i residui insolubili.
Campioni proteici
Estratti di tessuti o cellule
Proteine ricombinanti “etichettate” con
antigeni (“tags”: HA, T7)
Virus interi purificati
Localizzazione cellulare (nucleo,
membrana, citoplasma)
Estrazione delle proteine
Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine
e inibisce le proteasi cellulari
 Concentrazione dei sali
 Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS)
 pH
 Inibitori di proteasi
 Bassa temperatura (ghiaccio)
Proteasi
Inibitori proteasi:
Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF
Elettroforesi
Analisi
elettroforetica
delle proteine del
siero
Elettroforesi
La velocità di una molecola
carica che si muove in un
campo
elettrico
è
direttamente
proporzionale
alla forza del campo elettrico
(E) e alla carica della
molecola
(q)
ed
è
inversamente proporzionale
alle dimensioni della molecola
e alla viscosità del mezzo in
cui si muove (forze frizionali
fo resistenza):
v = Eq/f
dove f=6πrη
Fattori che influenzano
la velocità di migrazione
CAMPIONE (Carica, Dimensioni,
Forma)
TAMPONE (Concentrazione, pH)
SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione
molecolare)
SUPPORTI
Non setaccianti

(Carta), acetato di cellulosa
Setaccianti


Gel di poliacrilammide(PAG)
Gel di Agarosio
Elettroforesi su gel
Metodo per separare le molecole (DNA, RNA,
proteine, etc.) sulla base di proprieta’ fisiche o
chimiche quali:
(1) dimensioni
(2) forma
(3) carica elettrica
Elettroforesi di DNA
I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammide
I campioni di DNA vengono caricati ed e’ applicata una differenza
di potenziale
Il DNA, carico negativamente, migra verso l’elettrodo “+”
I frammenti di DNA piu’ piccoli migrano piu’ velocemente
Elettroforesi di Proteine
Piu’ complessa dell’elettroforesi di DNA
Proteine diverse hanno cariche diverse
 Le proteine variano molto per forma

Generalmente il gel e’ fatto di
poliacrilammide
Perche’ usare Gel di
Poliacrilammide per
separare le proteine?
I gel di poliacrilammide hanno una trama piu’ compatta
I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio
Le proteine sono molto piu’ piccole del DNA




Amminoacido medio = 110 Da
Paio di nucleotidi medio = 649 Da
1 kilobase di DNA = 650 kDa
1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa
Elettroforesi di proteine
Condizioni Non Denaturanti
Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle
proteine prima dell’elettroforesi



Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°;
legami disolfuro covalenti)
Le proteine conservano la loro carica normale
Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma
Nome
Carica
Massa
Proteina Q
+3
30kD
Proteina R
4
42kD
Forma
Elettroforesi di proteine
Condizioni denaturanti
Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico)
prima dell’ elettroforesi (SDS-PAGE)
 Le molecole di SDS si legano alle proteine
 Le proteine perdono la loro normale forma
 Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa
 Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base
delle loro dimensioni
Carica Massa
+3
30kD
4
42kD
Carica Massa
SDS
300 30kD
420 42kD
SDS-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis (SDS-PAGE)
CH3
CH2
CH2
SDS (Sodio Dodecil
Solfato)
CH2
CH2
CH2
Solubilizza e denatura le
proteine
 Aggiunge cariche
negative alle proteine

CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
O
-
O
S
SDS
O
O
Proteina Nativa
Carica netta: -4
Proteina trattata con SDS
Carica netta: Molto (-)
Sistemi per la corsa di SDS-PAGE
Amersham
Biosciences
Bio-Rad
Piccolo (8 x 10 cm)
Medio (16 x 16 cm)
SDS-PAGE
acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%
Colorazione con Blu di Coomassie
Come funziona un Gel
SDS-PAGE ?
Le proteine
cariche
negativamente
si muovono
verso l’elettrodo
positivo
Proteine piu’
piccole si
muovono piu’
velocemente
Le proteine si
separano per
dimensione
s-s
SDS, calore
Proteine con SDS
–
+
Cosa c’e’ nel
buffer di caricamento?
Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8)
SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e
fornire loro una carica negativa complessiva
Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei
pozzetti
Un agente riducente (DTT o b-Mercaptoetanolo) per rompere i
legami disolfuro
Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni
Il Gel
E’ costituito da due parti:
Stacking gel: 4-5% gel superiore, pH 6.8
 Running gel: 8-14% gel separatore, pH 8.8
 Le molecole di acrilammide sono tenute
assieme dalla bis-acrilammide, formando
una struttura a lattice
 Polimerizzazione piu’ rapida aggiungendo
catalizzatori: TEMED e APS

Il Gel
Componenti del gel SDS-PAGE
Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide
Tris-HCl pH 6.8 oppure Tris-HCl pH 8.8
SDS
ddH2O
TEMED
APS (ammonio persolfato)
Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)
Come funziona:

Proteine vengono caricate,
viene applicata una corrente
elettrica





Includere un marker di peso
molecolare colorato
10-50ug di estratto proteico
totale
0.1-1ug di proteina purificata
Ioni Cloruro (-) / Proteina /
Glicina (+)
Si muovono verso il gel
separatore (“resolving”)

Differenze di pH causano la
ionizzazione della glicina,
permettendo alle proteine di
migrare nel gel separatore
Il Gel
–
Stacking
pH 6,8
Resolving
pH 8,8
+
Il Gel
% di acrilammide
consigliata
8%
10%
12%
Dimensioni delle
proteine
40-200 kDa
21-100 kDa
10-40 kDa
Visualizzazione delle proteine nel gel
I due metodi piu’ usati sono:
Colorazione con il Coomassie Brilliant
Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere
visualizzato ~1ng di proteina per banda)
Coomassie staining
Silver staining
Stima dei pesi molecolari
mm
8.5
12.0
18.5
41
28.0
33
34.0
19
41.5
250
Dimensioni in kDa
kD
203
135
86
200
150
100
50
0
8
44.5
0
20
40
Distanza (mm dal pozzetto)
60
Stima dei
pesi
molecolari
Western Blotting
Southern Blot: Per l’analisi del DNA.
(sonda = DNA o RNA).
Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA.
(sonda = DNA o RNA).
Western Blot: Per l’analisi delle proteine.
(sonda = anticorpo).
Cosa e’ un Western Blot?
Una tecnica in cui le proteine sono separate
mediante elettroforesi su gel e
successivamente trasferite su un supporto
(membrana o filtro). Successivamente una
specifica proteina viene identificata mediante
la sua reazione specifica con un anticorpo.
A cosa serve il Western Blot?
Qual e’ la proteina che mi interessa?

SDS-PAGE (non certo)


Si basa sul confronto di peso molecolare
Western blot (certo)

Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo
–
?
+
Fasi di un Western Blot
Prima fase: elettroforesi su gel.
(Le proteine del campione vengono separate su un
gel in base alle loro dimensioni)
Seconda fase: trasferimento su membrana.
(Le proteine nel gel sono poi trasferite su una
membrana di nitrocellulosa mediante un campo
elettrico)
Terza fase: saturazione o “blocking”.
(La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni
non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)
Fasi di un Western Blot
Quarta fase: legame dell’anticorpo primario.
(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata
sulla membrana)
Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario.
(L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o
HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’
legato alla proteina sulla membrana)
Sesta fase: rivelazione o “detection”.
(L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un
substrato che, in corrispondenza della proteina specifica,
sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)
Western blot: seconda fase
Immobilizzazione e trasferimento
Le proteine nel gel sono ancora in soluzione

Le bande diffondono e si confondono col tempo
E’ necessaria l’immobilizzazione per:


Preservare in maniera permanente l’esperimento di
elettroforesi
Permettere il riconoscimento di proteine specifiche
La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su
membrana



Nitrocellulosa
PVDF (Polivinilidene fluoride)
Nylon
Western blot: seconda fase
Immobilizzazione e trasferimento
membrana
Western blot: seconda fase
Immobilizzazione e trasferimento
Elettroblotting




Apparato di trasferimento
Il gel e’ messo tra strati di carta da filtro con la
membrana a diretto contatto col gel sul lato verso
l’elettrodo positivo
Viene applicato un campo elettrico e le proteine
migrano fuori dal gel verso l’elettrodo positivo e si
legano alla membrana
Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento,
decomposizione del tampone e degradazione
delle proteine
Western blot: seconda fase
Immobilizzazione e trasferimento
Trasferimento dal catodo
(-) all’ anodo (+)
1)
2)
3)
4)
5)
6)
Spugnette
3 fogli di carta da filtro
imbevuti di tampone di
trasferimento
Gel
Membrana
3 fogli di carta da filtro
imbevuti di tampone di
trasferimento
Spugnette
Apparato per il trasferimento “Semi-dry”
Western Blotting
-
Buffer-soaked
filter papers
+
Nitrocellulose
membrane
Gel
Buffer
Electrode
SDS-PAGE
Direction of
transfer
Assemble ‘sandwich’
Wet blotting
Graphite Electrode Plates
-
Stained
(Red
Ponceau)
+
Semi-dry blotting
Nitrocellulose with bound proteins
Western blot: seconda fase
Immobilizzazione e trasferimento
Componenti del tampone di
trasferimento:
25mM Tris
 190mM glicina
 20% metanolo

3
Western blot: terza fase
saturazione o “blocking”
Per saturare i siti idrofobici
liberi sulla membrana
Per prevenire il legame
dell’anticorpo primario alla
membrana stessa
Latte scremato o Albumina
di Siero Bovino (BSA)
4
Western blot: quarta fase
incubazione con anticorpo primario
L’anticorpo primario riconosce la proteina di
interesse e non lega le altre proteine
immobilizzate sulla membrana
Anticorpi come sonde:


Molto sensibili
Possono essere “prodotti”



Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali)
Generando anticorpi monoclonali (mAb)
Economici
Anticorpi
Ab + Ag
AbAg
Kd
Kd =
[Ab] = 10-9 M
[AbAg]
Anticorpi
Anticorpi (immunoglobuline, Ig)
Una proteina a forma di
Y secreta nel sangue in
risposta ad uno
specifico antigene,
come un batterio o un
virus, che neutralizza
l’antigene legandosi
specificamente ed esso
e producendo una
risposta immunitaria.
Anticorpi policlonali
Produzione
Immunizzazione ripetuta dell’animale con
l’antigene (peptide, proteina purificata o
ricombinante)
Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di
produzione dell’anticorpo ed e’ purificato il
siero
Il “pool” degli anticorpi riconosce molti epitopi
dell’antigene usato per l’immunizzazione
Anticorpi monoclonali
Riconoscono solo
un epitopo
Western blot: quarta fase
incubazione con anticorpo primario
5
Western blot: quinta fase
Incubazione con anticorpo secondario
Anticorpi
Anticorpo primario

Riconosce la
proteina
Anticorpo secondario





Lega l’anticorpo primario
Generalmente prodotto in
una specie diversa
Coniugato con un enzima
Il substrato dell’enzima
sara’ convertito in un
prodotto colorato
Puo’ anche essere
radioattivo o fluorescente
Western blot: quinta fase
Incubazione con anticorpo secondario
6
Western blot: sesta fase
rivelazione o “detection”
Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del
rafano (HRP: horseradish peroxidase)

Conversione di un substrato colorimetrico in un
precipitato colorato
Substrati Chemioluminescenti


Emettono luce se convertiti dall’enzima
Possono essere visualizzati su lastre radiografiche
Marcatura radioattiva
Anticorpi secondari biotinilati
Western blot
HRP
Anticorpo primario
substrato
HRP
Anticorpo secondario
luce
Rivelazione
Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce
pg proteina
A cosa serve il Western Blot?
Densita' media
(intensita')
Quanta proteina di interesse c’e’?
Proteina
di interesse
Bande non
specifiche
100
80
60
40
20
0
1
100
10000
[Proteina], pg
Pg di Proteina