MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
La marcatura degli acidi nucleici è una delle tecniche di base nello
studio della Biologia Molecolare, rappresenta infatti una tappa
preliminare per applicazioni inerenti lo studio di genomi come:
- IBRIDAZIONE (Southern, Northern, Colony Ibridization ecc)
- DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA
- FOOTPRINTING
- ANALISI DEI TRASCRITTI
- ECC.
La marcatura del DNA
La marcatura del DNA, in alternativa alla colorazione con
Etidio Bromuro, rappresenta una modalità per la
visualizzazione del DNA.
La marcatura consente di determinare la posizione di una
particolare molecola di DNA su una membrana di nylon o di
nitrocellulosa, su un cromosoma o su un gel, individuando il
segnale emesso dal marcatore e permettendone quindi la
visualizzazione.
Per alcune applicazioni vengono utilizzate anche molecole di
RNA marcate.
La marcatura è più sensibile della fluorescenza per cui sono
necessarie quantità inferiori per la rivelazione.
ETIDIO BROMURO
(FLUORESCENZA)
AUTORADIOGRAFIA
(RADIOATTIVITA’)
ISOTOPI
Un atomo è costituito da un nucleo carico positivamente circondato da
una nuvola di elettroni carichi negativamente; nel nucleo sono presenti i
protoni e i neutroni, la cui somma è detta numero di massa (A). Tuttavia
gli atomi di un determinato elemento non contengono tutti lo stesso
numero di neutroni, portando a variazioni di numero di massa.
Atomi con differente numero di massa vengono detti ISOTOPI
(radioattivi e pesanti).
La stabilità di un isotopo dipende dal rapporto tra neutroni e protoni nel
nucleo: esistono isotopi stabili (pesanti) e isotopi instabili che emettendo
radiazioni e decadono nel tempo.
Il decadimento è radiattivo, per cui tali isotopi vengono detti
RADIOISOTOPI.
Gli isotopi PESANTI invece si utilizzano nella centrifugazione in
gradiente di densità (Messelson e Sthal con 15N)
I radioisotopi utilizzati in biologia molecolare emettono
radiazioni beta.
A causa della pericolosità delle radiazioni occorre operare in condizioni di
particolare attenzione.
- Le manipolazioni vengono effettuate in un laboratorio apposito, detto
dei radioisotopi, munito di cappe e docce per la decontaminazione.
- Occorre inoltre proteggere occhi e mani mediante l’utilizzo di schermi
protettivi e guanti in lattice evitando qualsiasi contatto fisico con la
sorgente di radiazioni, facendo attenzione a monitorare sempre con un
contatore GEIGER l’emissione della radioattività.
- Lo smaltimento dei rifiuti avviene secondo norme ben precise e molto
meticolose.
- Le confezioni di radionuclidi (32P, 35S ecc) vanno conservati in
contenitori di piombo e isolati da tutte le altre sostanze di laboratorio.
Ecc. ecc.
Il segnale radioattivo prodotto può essere quantificato mediante
un contatore di scintillazioni (SCINTILLATORE) , ma per la
maggior parte delle applicazioni di biologia molecolare sono
richieste informazioni posizionali che si ottengono tramite
esposizione di una lastra sensibile ai raggi X (autoradiografia) o
di uno schermo fluorescente sensibile alle radiazioni
(phosphorimaging).
Con 32P si ottiene un’elevata sensibilità perché questo isotopo ha
un’alta energia di emissione, ma ha una bassa risoluzione a causa
della dispersione del segnale. Un isotopo a bassa emissione come
35S o 3H dà una minore sensibilità ma una maggiore risoluzione.
Per marcare il DNA vengono utilizzati radioisotopi che entrano a far parte dei
nucleotidi.
E’ possibile sintetizzare nucleotidi in cui:
- un atomo di fosforo è sostituito con P32 o con P33,
- un atomo di ossigeno del gruppo fosfato è sostituito con S35
- uno o più atomi di H sono sostituiti da H3.
Questi nucleotidi funzionano ancora come substrati per la DNA polimerasi e
vengono incorporati in una molecola di DNA in sintesi.
I nucleotidi marcati o i singoli gruppi P possono essere legati ad una estremità
(marcatura esterna) o inseriti all’interno della molecola (marcatura interna).
La marcatura degli acidi nucleici può essere:
-RADIOATTIVA ( O CALDA)
-NON RADIOATTIVA (o FREDDA)
1-MARCATURA RADIOATTIVA
MARCATURA ALLE ESTREMITA’ 3’
5’
3’
3’
5’
+ Enzima di Restrizione
5’
3’
CT
3’
GAATTC
5’ CTTAAG
3’TC
5’
3’
5’
+ DNA Polimerasi
+ dNTP
+ dATP α 32P
5’
3’
TT** G
AATTC
CTTAA
G** TT
3’
5’
γ
β
α
MARCATURA ALLE ESTREMITA’ 5’
5’ P
3’
P
3’
5’
+Fosfatasi alcalina
5’
3’
3’
5’
+ Polinucleotide chinasi
+ ATP γ 32P
5’
3’
*
*
3’
5’
Si lega solo il fosfato marcato in γ sul nucleotide al 5’ defosforilato
MARCATURA IN 5’ DEGLI mRNA
7-METIL-GUANOSINA
α 32 P
5’
5’
CONDENSAZIONE 5’-5’
GUANILIL TRANSFERASI + α 32P GTP
mRNA
FOOTPRINTING
MARCATURA INTERNA
- NICK TRANSLATION
- RANDOM PRIMING
NICK TRANSLATION
E' una reazione rapida ed efficiente per marcare uniformemente DNA a doppio
filamento. La reazione si basa sull'attività sequenziale di due enzimi sulla molecola
di DNA. La reazione ricalca quanto avviene in vivo per la riparazione dei danni del
DNA batterico dovuto ai raggi UV.
In una prima fase l'endonucleasi DNasi I produce su entrambi i filamenti un nick,
cioè una rottura del legame 5'P - 3'OH tra due basi adiacenti. A questo punto si
aggiunge la DNA polimerasi I con i 4 deossinucleotidi trifosfati (dNTPs di cui uno
marcato in α) in un'opportuna miscela di reazione.
La DNA polimerasi I si lega all'estremità 3' prodotta dall'attività endonucleotidica
della DNasi I. Tale estremità funge da innesco per l'attività dell'enzima DNA
polimerasi I che è caratterizzato anche da un attività esonucleotidica 5' -> 3' che
elimina le basi non marcate che incontra sostituendole, grazie alla sua attività
polimerasica, con le basi marcate presenti nella miscela di reazione.
Il risultato finale della reazione sarà una molecola a doppia elica marcata in un alta
percentuale dei suoi nucleotidi.
NICK TRANSLATION
DNAsi
DNA pol I
+α
Si ottengono molecole con elevata attività specifica.(>109cpm/ug di DNA)
La marcatura avviene su entrambe le eliche.
32P
dATP
NICK TRANSLATION
RANDOM PRIMING
DENATURAZIONE
APPAIAMENTO (aspecifico) DI
ESANUCLEOTIDI
xPx
xPx
xPx
xPx
xPx
xPx
xPx
RIEMPIMENTO CON
dNTP
α 32P dATP (P)
Pol di Klenow
Si possono ottenere sonde con un alta attività specifica, da 10 a 50 volte superiore a quelle ottenute con la Nick translation.
Si possono marcare anche frammenti molto corti per i quali la nick translation non è molto efficace.
RANDOM PRIMING
MARCATURA NON RADIOATTIVA
VANTAGGI:
• Eliminazione dei pericoli alla salute e all’ambiente derivanti dai
radioisotopi
• Possibilità di costruire sonde stabili
• Possibilità di utilizzarle in concentrazioni maggiori, così da
incrementare la sensibilità senza causare problemi d’innalzamento
del segnale di fondo
• Possibilità di accorciare i tempi di analisi
• Ridurre i costi
• ecc
MARCATURA NON RADIOATTIVA
La marcatura degli acidi nucleici non radioattiva o fredda avviene secondo due
modalità:
MARCATURA DIRETTA - I gruppi reporter sono legati direttamente al DNA.
I gruppi reporter sono costituiti da droghe fluorescenti (Fluoresceina, Rodamina) o
da enzimi marker chemiluminescenti (Fosfatasi alcalina, Perossidasi).
MARCATURA INDIRETTA - I gruppi reporter sono legati indirettamente al
DNA attraverso una interazione tra un gruppo di modificazione della sonda
(ibridazione) e una molecola indicatrice universale che in maniera specifica
riconosce e lega la sonda modificata. Quindi i sistemi indiretti richiedono innanzi
tutto l’alterazione della sonda mediante l’introduzione di un particolare gruppo di
modificazione.
Gruppi di modificazione
: Biotina (o Vitamina H)
Digossigenina
Fluoresceina
Ecc.
Natura dei gruppi reporter:
•Fluorescenti. Vari fluorofori con emissioni di lunghezza d’onda
diversa (cioè di diversi colori) vengono incorporati nei nucleotidi o
attaccati direttamente alle molecole di DNA (marcatura diretta) e,
successivamente, rivelati con una pellicola adatta, con un microscopio
a fluorescenza o con un rivelatore di fluorescenza.
•Chemiluminescenti. Il segnale non è generato direttamente dalla
molecola, ma deve essere “sviluppato” mediante trattamento con
composti chimici (es. marcatura con fosfatasi alcalina rivelata con
diossietano per produrre chemiluminescenza)
MARCATURA CON DIGOSSIGENINA
Si basa sull’incorporazione nella catena di DNA, in fase di sintesi,
di deossiuridina trifosfato il quale, mediante un braccio
spaziatore, porta legata la digossigenina (Dig-dUTP).
La sonda così ottenuta viene utilizzata per tutti i tipi di
ibridizzazione su filtro e viene rivelata immunologicamente
utilizzando un anticorpo monoclonale anti-digossigenina
coniugato con la fosfatasi alcalina.
Si forma così un complesso aptene-anticorpo che può essere
evidenziato aggiungendo un adatto substrato della fosfatasi
alcalina (X fosfato) e il colorante nitroblutetrazolio (NBT).
(sonda)
MARCATURA CON BIOTINA
La reazione consiste nell’incorporazione nel DNA di nucleotidi biotinilati.
I nucleotidi biotinilati vengono inseriti all’interno di una molecola di DNA
attraverso marcature interne o alle estremità.
Dopo aver utilizzato la sonda in esperimenti di ibridazione, il filtro viene
fatto reagire con avidina o streptavidina. Queste a loro volta sono legate a
particolari molecole indicatrici quali fluorocromi o particolari enzimi
(fosfatasi, perossidasi). Fornendo i substrati per questi enzimi si ottiene lo
sviluppo di una reazione colorata.