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Lezione 11 2010-11
A Brief Introduction to Molecular Systematics David S. Horner Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie [email protected] Allineamento Che Cosa è un allineamento? • E’ una serie di ipotesi di omologia posizionale SUGAR SUCRE SUGAR X SUGR SUCRE SUCRE SUGARSUC –RE ---------------------------- S U ? ?R? SUGARSUC –RE ZUCKER SOKKER SAKARI AZUCAR AçUCAR SUG-ARSUC– - RE ZUCKERSOKKERAZUC-ARSAK-ARI AçUC-AR-------------------- S U C(K)A R - Possiamo Valutare un Allineamento • Match = +2 • Mismatch = -1 • Gap = -2 G | G A | A T A T | T C - +2 +2 -1 +2 -2 C | C G C T | T +2 -1 +2 =6 punti Models of Amino acid Replacement Exchangeability Parameters •Si può calcolare un “punteggio di similarità” tra 2 sequenze, in base al punteggio scelto: Human: W C T F G T T Mouse: W C A W G T T 11 9 0 1 6 5 5 score = 37 • Saul G. Needleman – Christian D. Wunsch 1970 Allineamento ottimale di due sequenze H P A W H E A E E A G A W G H E E La formula • Matrice M = (m+1)x(n+1) • La posizione m(0,0) è “inizializzata” a zero • Poi: m(i,j) è uguale al massimo tra tre possibilità • s(xi,yj) è il costo (matrici) della sostituzione dell’i-esima lettera della sequenza X con la j-esima della sequenza Y • d è il costo di una cancellazione (inserimento) • Alla fine, la casella in basso a destra conterrà il punteggio dell’allineamento m(i 1, j 1) s( x , y ) i j m(i, j ) max m(i 1, j ) d m(i, j 1) d Allineamento “globale” yj allineato con un “gap” Allinea carattere con carattere m(i-1,j-1) m(i,j-1) s(xi,yj) d m(i-1,j) xi allineato con un “gap” d F(i,j) While building the table, keep track of where optimal score came from, reverse arrows BLOSUM62 Amino Acid Log-odd Substitution Matrix H E A G A W G H E E 0 -8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 P -8 -2 -9 A 16 W 24 H 32 E 40 A 48 E 56 17 25 33 42 49 57 65 73 “Traceback” Segui le frecce a partire dal basso a destra • Diagonale: Lettera con lettera • Su: Gap nella sequenza sopra • Sinistra: Gap nella sequenza sotto H E 0 -8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 P -8 -2 -9 A -3 16 10 W -6 24 18 11 H -8 32 14 18 13 E -8 40 22 A - - - A G A W G H E E 17 25 33 42 49 57 65 73 -4 12 20 28 36 44 52 60 -7 -5 15 -9 -9 16 16 13 21 29 37 -7 13 -3 -7 12 15 HEAGAWGHE-E -3 --P-AW-HEAE - 11 19 3 -5 -5 2 Ricerca in Database • “Trovami nel database le sequenze che allineate con la mia producono un buon punteggio” • Nelle ricerche nei database spesso ci si “accontenta” di trovare similarità locali (domini conservati, siti attivi, ecc.) • Il database è enorme: occorrono metodi “veloci” (che non compilino tutta la tabella) per confrontare la nostra sequenza ignota con migliaia di altre sequenze: FASTA, BLAST • Punteggi piu alto che atessa indicono omologia Allineamento Progressivo • Inventato da Feng e Doolittle nel 1987. • Essenzialmente è un metodo euristico e in quanto tale non garantisce il reperimento dell’allineamento “ottimale”. • Richiede n-1+n-2+n-3...n-n+1 allineamenti a coppie di sequenze (pairwise) come punto di partenza - (n(n-1))/2 • La sua implementazione più nota è Clustal (Des Higgins) Allineamenti pairwise • Partire da tutti I possibili allineamenti pairwise fra ciascuna coppia di sequenze. Ci sono (n1)+(n-2)...(n-n+1) possibilità. • Calcolare la “distanza” per ogni coppia di sequenze sulla base di questi allineamenti pairwise isolati. • Generare una matrice di distanza e un albero filogenetico. Caso in cui una terza sequenza vada allineata alla prime due: ogni volta che sia necessario introdurre un gap per migliorare l’allineamento, le due entità vengono trattate come sequenze singole. + H H - D P E - A P -AW-HEAE + GAWGHE-E -AW-HEAE 0.5H 0.5E 0.5A ……. 0.5- 0.5- 0.5P ……. -8 H -16 D -24 P -32 H - E - -16 -24 Profile AGAWGHE-E P-AW-HEAE Progressione • L’allineamento multiplo viene progressivamente costruito in questo modo: ogni passaggio è trattato come un allineamento pairwise, a volte ciascun membro del pair (coppia) rappresenta più di una sequenza. Progressive Alignment-Minimo Locale • Problemi potenziali: – Problema del minimo locale. Se viene introdotto un errore precocemente nel processo di allineamento, non è possibile correggerlo più tardi nel corso della procedura. Muscle www.drive5.com/muscle Allineamento di sequenze di DNA codificanti per proteine • Non è raccomandabile allineare sequenze nucleotidiche di geni codificanti per proteine. ATGCCCCTGTTAGGG ATGCCCCT-GTTAGGG ATGCTCGTAGGG ATG---CTCGT-AGGG http://www.cbs.dtu.dk/services/RevTrans/ Allineamento di sequenze di DNA codificanti per proteine Allineare le seq. Proteiche, inserire 3 gap nelle seq. nucleotidiche per ogni gap nel’allineamento proteico MetProLeuLeuGly ATGCCCCTGTTAGGG MPLLG M-LVG ATGCTCGTAGGG MetLeuValGly ATGCCCCTGTTAGGG ATG---CTCGTAGGG Che Cosa è un allineamento? • E’ una serie di ipotesi di omologia posizionale Allineamenti, omologia posizionale e siti allineati con segnale potenzialmente fuorviante Siamo confidenti che tutti i siti sono allineati correttamente? Possiamo escludere siti che non sono bene allineati Esclusione di siti non bene allineati • Si fa manualmente o con software come Gblocks • http://molevol.ibmb.csic.es/Gblocks.html • Rimuove i block con livelli basi di conservazione in modo obiettivo Terze Posizioni di codoni • Tendono essere piu saturati in termini di numero di sostituzioni, particolarmente quando le distanze genetiche sono grandi • Long Branch Attraction • A volte vengono escluse Metodi Basati Sulle Distanze Genetiche Cambiamenti multipli a un singolo sito cambiamenti nascosti Seq 1 AGCGAG Seq 2 GCCGAC Numero di cambiamenti pos 1 A G pos 2 G pos 3 C A T G C C 3 1 2 Differences Substitutions Distanze Misure di quanto differenti sono due sequenze Il numero di eventi evolutivi che sono intervenuti dopo la divergenza fra due sequenze. La distanza più semplice: p-distance = la proporzione di siti che non sono uguali (Queste non sono buone misure dovuto alla saturazione ) Modelli dell’evoluzione molecolare un “modello del processo”: una descrizione del meccanismo di cambiamenti molecolari. Due approcci per la costruzione di modelli. EMPIRICAMENTE, possiamo usare proprietà stimate da confronti fra un numero alto di sequenze osservate. (valori fissi di parametri) Con un metodo PARAMETRICO, usando valori derivati dai dataset sotto analisi Modelli dell’evoluzione molecolare L’evoluzione molecolare è modellizzata come un processo probabilistico dipendente dal tempo. (processo stocastico). Assunzioni “standard”: Tutti i siti evolvono independentamente La velocità di sostituzione è costante rispetto al tempo e in organismi diversi. La composizione (di basi o aa) è costante fra diversi organismi (condizione stazionaria). Le probabilità di vari tipi di sostituzioni sono uguali per tutti i siti e non cambiano nel tempo. Correzioni per sostituzioni sovrapposte Jukes and Cantor – tutte le sostituzioni sono “uguali” Kimura 2-parameter – differenza fra transizioni e transversioni Jukes-Cantor (1969) 1 solo parametro Composizione di basi: [1/4, 1/4, 1/4, 1/4] Tutti i 12 tassi di sostituzioni “sono” uguali (a) A T C G Il logaritmo naturale viene usato per correggere per sostituzioni sovrapposte • Se 2 sequenze sono 95% identiche, differiscono al 5% o 0.05 (D) dei siti, quindi: – dxy = -3/4 ln (1-4/3 0.05) = 0.0517 • Comunque, Se 2 sequenze sono 50% identiche, differiscono a 50% o 0.5 (D) dei siti, quindi: – dxy = -3/4 ln (1-4/3 0.5) = 0.824 Modello di Kimura a 2 parametri (1980) 2 parametri A Composizione di basi: [1/4, 1/4, 1/4, 1/4] Velocità di transizione (a) Velocità di transversione (b) T C G Modello Kimura 2P : P = transizioni / numero di posizioni Q = transversioni / numero di posizioni •D = -1/2 ln[ (1 - 2P - Q) * sqrt(1 - 2Q) ] • M. Kimura, J. Mol. Evol. 16; 111-120 (1980). Felsenstein (1981) composizione di basi diversa: [pA pC pG, pT] Tutti I 12 tassi di sostituzione “sono” uguali (a) A 3 parametri liberi T C G Hasegawa, Kishino and Yano composizione di (1985) basi diversa: [pA pC pG, pT] Velocità di transizione (a) Velocità di transversione (b) A 5 parametri liberi T C G General Time Reversible (1984) composizione di basi diversa: [pA pC pG, pT] 6 tassi di sostituzione diversi A 9 parametri liberi/indipen denti T C G Metodi di “Distanza” • I metodi di “clustering” usano algoritmi per generare alberi – UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages): produce un albero additivo, radicato, che si conforma all’orologio molecolare – Neighbor-joining: produce un albero additivo, non radicato Approci basati su criteri di ottimalità: least-squares, minimum evolution,... Stimare un albero con le distanze Distanze additive: • Se potessimo calcolare accuratamente il vero numero di eventi evolutivi che sono accaduti dalla divergenza di due sequenze sulla base del numero di divergenze osservate, queste distanze sarebbero additive. Metodi di clustering • UPGMA distanze additive e ultrametriche => basato sull’assunzione di un orologio molecolare => molto sensibile a tassi di sostituzioni non uguali. Meglio usare altri algoritmi di clustering e.g. Neighbor-joining B C D E F A 2 4 6 6 8 B C D E 4 6 6 8 6 6 8 4 8 8 B C D E F A 2 4 6 6 8 B C D E 4 6 6 8 6 6 8 4 8 8 Clusteriziamo le 2 seq più vicine, generiamo una nuova matrice dove queste seq. vengono considerate come un cluster unico. dist(A,B),C = (distAC + distBC) / 2 = 4 dist(A,B),D = (distAD + distBD) / 2 = 6 dist(A,B),E = (distAE + distBE) / 2 = 6 dist(A,B),F = (distAF + distBF) / 2 = 8 A,B C 4 D 6 E 6 F 8 C D E 6 6 8 4 8 8 dist(D,E),C = (distDC + distEC) / 2 = 6 dist(D,E),F = (distDF + distEF) / 2 = 8 Dist(D,E)(A,B)= (distD(AB) + distE(AB)) / 2 = 6 AB C C 4 DE 6 6 F 8 8 DE 8 dist(ABC),F = (dist(AB)F + distCF) / 2 = 8 dist(ABC),(DE) = (dist(AB)(DE) + distC(DE)) / 2 = 6 AB,C DE 6 F 8 DE 8 dist(ABC,DE)F = (dist(ABC)(F) + dist(DE)(F)) / 2 = 8 F ABC,DE 8 B C D E F A 2 4 6 6 8 B C D E 4 6 6 8 6 6 8 4 8 8 Pero…… UPGMA is a weak clustering algorithm • Neighbor joining is more complicated but better • Other clustering algorithms available (least squares, minimum evolution etc) Maximum Parsimony Identifica l’albero che richiede il minimo numero di cambiamenti evolutivi per spiegare le differenze osservate tra le sequenze Spesso non si può identificare un unico albero per grandi set di dati esaustiva non è possibile una ricerca Maximum Parsimony Assunzioni implicite riguardo all’evoluzione, i cambiamenti sono rari (la migliore ipotesi è quella che richiede il minimo numero di cambiamenti) Tutti tipi di sostituzione avengono con la stessa probibilità Molto sensibile SOSTITUZIONI a SATURAZIONE DI Siti Informativi e non-informativi 1 2 3 1 2 1 2 4 3 4 4 3 Site Sequ ence 1 2 3 4 1 2 3 4 5 G G G G G A A A C G T T A C G T G G A A 6 T T T T 7 C C T T 8 C C C C 9 10 A C G C A C G C Siti informativi sono quelli che ci permettono distinguere tra alberi diversi sulla base di quanti sostituzioni sono postulati. Un sito informativo deve avere almeno due basi diversi, e ciascuno di questi basi dev’essere rappresentato almeno 2 volte Site Sequ ence 1 2 3 4 1 2 3 4 5 G G G G G A A A C G T T A C G T G G A A I site 2 site 3 G G A 1 G T 4 T 4 A3 G A C T A 2G A T3 1C 2C site 9 A 1G 2 site 7 A3 1C 2 site 5 A G 7 C C T T 8 C C C C 9 10 A C G C A C G C II 1G 2 6 T T T T G A 4 1G 3 A A2 A T T T 1G 3 A A 4 G2 T 4 G2 A T3 1C T4 3T T A3 1A G4 3A A 4 changes A 1C 3 III A T G A 4 1G 4 A A A 1C 4 T 4 A 1C T4 4T G2 1A G4 4G A 3 G2 T T 1G C2 5 changes A2 T 3 G2 A A A 3 C2 T T T3 G2 A A A3 6 changes 1 A 2 C 3 C 4 T [A,C] 5 T [C] [C,T] [T] 2 Cambiamenti Siti Ancestrali 1 A 2 C 3 C 4 T [A,C] - C 5 T [C] - C [C,T] - T [T] 2 Cambiamenti Analisi di parsimonia • Dato un set di caratteri, ad esempio delle sequenze allineate, l’analisi di parsimonia determina l’adattamento (numero di passaggi) di ciascun carattere a un dato albero • La somma dei cambiamenti per tutti I caratteri è definita “Tree Length” (TL, lunghezza dell’albero) • Most parsimonious trees (MPTs, gli alberi più parsimoniosi) sono quelli che hanno TL minima Risultati dell’analisi di parsimonia • Vengono prodotti uno o più MPTs • Ipotesi riguardo all’evoluzione dei caratteri associate ad ogni albero (dove e quando sono avvenuti I cambiamenti) • Lunghezze dei rami (branch lengths) = numero di cambiamenti associati ai rami • Alberi sub-ottimali - opzionali Parsimonia -vantaggi • Metodo semplice • Sembra non dipendere da un modello esplicito di evoluzione • Produce sia alberi che ipotesi ad essi associate dell’evoluzione dei caratteri • Dovrebbe dare risultati accurati se I dati sono ben strutturati e se l’omoplasia è rara o ampiamente e casualmente distribuita su tutto l’albero Parsimonia -svantaggi • Può produrre risultati fuorvianti se c’è omoplasia concentrata in particolari parti dell’albero, per esempio: - convergenza thermofilica - bias nella composizione in basi - long branch attraction (tassi di sostituzione non uguali tra sequenze) • Sottostima le lunghezze dei rami (saturazione) • Il modello di evoluzione è implicito - il comportamento del metodo non è del tutto chiaro • Spesso giustificata da un punto di vista filosofico - dobbiamo preferire le ipotesi più “semplici” • Per molti sistematici molecolari questo argomento non è convincente Numero di alberi distinti in funzione del numero di taxa N taxa N trees 10 2*106 22 3*1023 50 3*1074 100 2*10182 1000 2*102860 Trovare gli alberi ottimali soluzioni esatte • Ricerca esaustiva esamina tutti gli alberi possibili • Tipicamente usata per problemi con meno di 10 taxa Trovare gli alberi ottimali soluzioni euristiche • Il numero di possibili alberi aumenta esponenzialmente all’aumentare del numero di taxa (esempio di problema NP complete) • Metodi euristici sono usati per esplorare il “tree space” in cerca degli alberi più parsimoniosi • Non è garantito che gli alberi trovati siano i più parsimoniosi Trovare gli alberi ottimali soluzioni euristiche • Branch Swapping: Nearest neighbor interchange (NNI) Subtree pruning and regrafting (SPR) Tree bisection and reconnection (TBR) Altri metodi.... Trovare gli alberi ottimali soluzioni euristiche • Nearest neighbor interchange (NNI) C A D E F B G A D C C E A D E F B G F B G Trovare gli alberi ottimali soluzioni euristiche • Subtree pruning and regrafting (SPR) A C D E F B G C D E C F G E F G B D A Trovare gli alberi ottimali soluzioni euristiche • Tree bisection and reconnection (TBR) C D E A F B G A E A C B G F D F B G D C E Ricerche Euristiche • In tutti casi, accetiamo un riarrangemento se produce un albero migliore di quello precedente. • Possiamo usare anche regole piu complesse (accetiamo se non e tanto peggio, e poi proviamo altre riarrangementi) • Facciamo “n” passi cosi (anche usando, per es., x passi di NNI dopo ogni passo di TBR) Alberi ottimali multipli • Parsimonia può generare piu di un albero più parsimonioso • Possiamo poi selezionare il “migliore” con criteri addizionali • Tipicamente relazioni comuni fra tutti gli alberi ottimali vengono riassunte in un albero consensus Consensus methods • Un albero consensus è una sintesi dei elementi comuni fra un gruppo di alberi • Ci sono vari metodi di consensus che differiscono rispetto a: – 1. Il tipo di accordo – 2. Il livello di accordo • Metodi consensus possono essere usati con alberi multipli derivanti da un’unica analisi o da analisi differenti Majority rule consensus A B C D E F G Numbers indicate frequency of clades in the fundamental trees B A E C A B C D F E D A G F B G 66 100 66 66 66 MAJORITY-RULE CONSENSUS TREE C E D F G Come valutare lo support per un albero • bootstrap: – Selezionare colonne da un allineamento multiplo con rimpiazzo (resampling with replacement) – Ricalcolare l’albero – Ripetere 100-1000 volte (calcolare 1001000 nuovi alberi) – Quanto spesso vediamo rami che mettono insieme sequenze o gruppi di sequenze? Bootstrapping • Costruire un nouvo set di dati con lunghezza uguale a quello originale. Colonne di caretteri vengono scelte casualemente dal dataset originale in modo tale che colonne orignali possono essere presente piu di una volta. • Fare un’analisi filogenetica e ricordare l’albero • Tornare al capo 100 (1000) volte The Bootstrap Original 1 A C B M C M 2 C A C 3 V V L 4 K R R 5 V L L 2x Scrambled 3 A V B V C L 4 K R R 3 V V L 6 I I L 7 Y F F 8 S S T 8 S S T 6 I I L A B C 3x 8 S S T 6 I I L 6 I I L A B C Nonsupportive Majority rule consensus A B C D E F G A B C E F D G A A B B E C C E D D F G 66 100 Numbers indicate frequency of clades in the fundamental trees F 66 66 66 MAJORITY-RULE CONSENSUS TREE G Bootstrapping • La concordanza fra gli alberi prodotti viene rappresentata con un albero “majority-rule consensus” • La frequenza con cui certi gruppi compaiono, le proporzioni di bootstrap (BPs), è una misura del supporto dei gruppi stessi • Informazioni addizionali sono riportate nelle tabelle di partizione Bootstrapping - an example Ciliate SSUrDNA - bootstrap 123456789 Freq ----------------Symbiodinium (2) 100 .**...... 100.00 Prorocentrum (3) ...**.... 100.00 .....**.. 100.00 Euplotes (8) 84 ...****.. 100.00 Tetrahymena (9) ...****** 95.50 Loxodes (4) .......** 84.33 100 ...****.* 11.83 Tracheloraphis (5) 100 ...*****. 3.83 Spirostomum (6) .*******. 2.50 100 .**....*. 1.00 Gruberia (7) .**.....* 1.00 Majority-rule consensus Ochromonas (1) 96 Partition Table Bootstrap - interpretazione • Purchè non ci siano evidenze di un forte segnale di distorsione (per esempio bias nella composione, grandi differenze nelle lunghezze dei rami), elevati BPs (> 85%) sono indicativi di un segnale filogenetico forte • Bassi BPs non necessariamente significano che la relazione evidenziata è falsa, ma semplicemente che non è fortemente supportata Bootstrap - interpretation • le BP sono depende sul numero di caratteri che sono consistenti con un clade e il livello di support per altri relazioni. • Ci fornicsono una stima relativa per il grado di support per un gruppo soto il modello e metodo di analisi. Seaview http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview.html PHYLIP • http://evolution.genetics.wa shington.edu/phylip.html NJPlot http://pbil.univlyon1.fr/software/njplot.html Maximum Likelihood Maximum likelihood • Try to identify the tree and model of substitution that MAXIMIZES the probability of observing the data (the alignment) Cos’è la probabilità di osservare un dato? • lanciamo una moneta, viene testa. Se assumiamo che si tratti di una moneta “onesta”, la probabilità di avere testa dovrebbe essere 0.5. • Se invece pensiamo che questa moneta dia testa nell’80% dei lanci, la probabilità di avere questo risultato dovrebbe essere 0.8! • QUINDI: La probabilità dipende dal modello! p =? Lezione: I dati rimangano costanti, il cambiamento è nel modello. Nela caso del secondo modello, la probabilità e più alta. MASSIMA VEROSIMGLIANZE OBIETIVO • Stimare la probabilità di osservare i dati, dato un albero filogenetico e un modello che descrive il processo dell’evoluzione. Probability of ( given p a,c,g,t a b b a c e d c c e a f d f g a ) Una regola…la regola dell’1 • la somma delle probabilità di tutte le possibilità è SEMPRE uguale a 1. • Es. per DNA p(a)+p(c)+p(g)+p(t)=1 Cos’è la probabilità di vedere un nucleotide 'G'? • Domanda:Data una sequenza di lunghezza 1, il nucleotide “G”, qual’è la probabilità dei dati? • Soluzione: Dipende dal modello dell’evoluzione (composizione). • E.g. – Model 1: frequenza di G = 0.4 => likelihood(G) = 0.4 – Model 2: frequenza di G = 0.1 => likelihood(G) =0.1 – Model 3: frequenza di G = 0.25 => likelihood(G) = 0.25 Per sequenze più lunghe? • Consideriamo un gene con lunghezza 2: Gene 1: ga • La probabilità di osservare questo gene è il prodotto delle probabilità di osservare ogni base. • Es. – p(g) = 0.4; p(a)=0.15 (per es) – probabilità(ga) = 0.4 x 0.15 = 0.06 …e così via per sequenze più lunghe • Gene 1: gactagctagacagatacgaattac • Model (di frequenza di basi): – p(a)=0.15; p(c)=0.2; p(g)=0.4; p(t)=0.25; – (La somma di tutte probabiltà dev’essere 1) Prob(Gene 1) = 0.000000000000000018452813 (anche la somma di probabilità di tutti geni =1 Considerazioni sui modelli • Possiamo vedere che il nostro modello non è quello ottimale per I dati osservati. Se avessimo usato questo modello: • p(a)=0.4; p(c) =0.2; p(g)= 0.2; p(t) = 0.2; La probabilità sarebbe stata: Prob(gene 1) = 0.000000000000335544320000 (un valore quasi 10,000 volte più alto) Lezione: I dati rimangano costanti, il cambiamento è nel modello. Nel caso del secondo modello, la probabilità e più alta. In quale modo si riferiscono queste considerazioni agli alberi filogenetici? • Consideriamo un allineamento di 2 sequenze: – Gene 1: gaac – Gene 2: gacc • Facciamo l’assunzione che questi geni sono imparentati da un albero semplice con lunghezze di rami. Aumentare la complessità del modello • In questo caso, non è possibile usare un modello che descrive solo la composizione. Dobbiamo includere il meccanismo di sostituzione. • Ci sono due parti in questo modello: l’albero e il processo (il processo è spesso chiamato “il modello”), in realtà il modello è composto sia dal processo che dall’albero. NB: Per evitare altra confusione, manteniamo la terminologia confusa. Il modello • Le due parti del modello sono: l’albero e il processo (il modello). • Il modello è composto dalla composizione e dal processo di sostituzione (I tassi di varie sostituzioni). Modello = + a b b a c e d c c e a f d f g a p a,c,g,t Un modello “time-reversible” semplice • Un modello semplice dice che la probabilità di una sostituzione da a a c (o vice versa) è 0.4, la composizione (p) a è 0.25 e la composizione (p) c è 0.25 . 0.4 . . 0.4 . . . . . . . . . . . P= p 0.25 0.25 . . Probabilità della terza posizione del nostro allineamento –Gene ancestrale: gaac –Gene derivata: gacc pa c 0.4 • p(a) =0.25; p(c) = 0.25; Se cominciamo con A, la probabilità di questo nucleotide è 0.25, mentre la probabilità della sua sostituzione con C è 0.4. Quindi, la probabilità di osservare questi dati è: *probabilità(D|M) = 0.25 x 0.4 =0.01 *La probabilità dei dati, dato il modello. Diverse lungezze di rami • Per rami corti, la probabilità che un carattere rimanga uguale è alta, la probabilità che venga sostituito è bassa (secondo la nostra matrice) • Per rami più lunghi, la probabilità di cambiamento dovrebbe essere più alta. • I calcoli precedenti sono basati sull’assunzione che la lunghezza del ramo descrive UNA Certain Evolutionary Distance or CED. • Se volessimo considerare un ramo con lunghezza 2CED, potremmo moltiplicare la matrice per se stessa (matrice2). Per valori più alti di CED units 1 2 3 10 15 20 30 0.0000300 0.0000559 0.0000782 0.0001620 0.0001770 0.0001750 0.0001520 P r o b a b i l i t à 0 10 20 30 40 Lunghezza del ramo