+lattosio

Struttura dei geni batterici
La replicazione è semiconservativa
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La replicazione è semidiscontinua
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La replicazione è bidirezionale
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(Cairns, 1961)
Struttura dei geni batterici
RNA polimerasi
l’elica 3’-5’ del DNA funge da stampo per la sintesi
dell’RNA (5’-3’)
nucleotidi inseriti in base alle regole della complementarità
RNA: ribosio invece del desossiribosio e U al posto di T
la sequenza “codificante” del DNA è uguale a quella
del messaggero
promotore: sequenza presente a monte di tutti i geni,
riconosciuta dal fattore sigma dell’RNA polimerasi, necessaria
per l’inizio della trascrizione.
La sequenza è conservata
promotori riconosciuti dal fattore sigma-70 di E. coli
mutazioni “down”:
diminuisce
l’efficienza del
promotore
TTGACa
TAtAaT
lettera maiuscola = basi più conservate (presenti in quella posizione
rispetto al +1 in quasi tutti i casi
lettera minuscola = basi presenti in molti casi ma non sempre
regolazione dell’espressione genica mediante
l’intervento di fattori sigma alternativi
geni “heat-shock”: CCCCCC
- 15/17 basi - CCCC
promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in
caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo
promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA
DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA
geni “spo” in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo
durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma
specificamente attivati in sporulazione
SEQUENZE PALINDROMICHE: sequenze ripetute e
invertite
5’- TGCA- 3’
3’- ACGT - 5’
lette allo stesso modo su
entrambi i filamenti del DNA (nella
stessa direzione)
rispetto all’asse di
simmetria le sequenze
sono specularmente
complementari
5’-ATCCGGAT-3’
3’-TAGGCCTA-5’
palindromi perfette =
palindrome perfetta a 8
coppie di basi
siti di restrizione
(endonucleasi specifiche)
5’-ATCCAAGTACGGAT-3’
PALINDROME IMPERFETTA
3’-TAGGTTCATGCCTA-5’
(terminatori della trascrizione)
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Terminatore forte o rho-indipendente:
-struttura secondaria stabile e forte per la presenza di
molte G e C nello “stem”
- sequenza di tante U al 3’ della struttura secondaria
(che facilita la separazione dell’ibrido DNA/RNA)
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Terminatore forte o rho-indipendente
Terminatore debole o rho-dipendente
Terminatore debole o rho-dipendente
Ordinare i seguenti promotori in base alla loro forza partendo da quello più forte:
a) TTAACC ...........17 basi............CCTAAG
b) TTGACC ................".................TATATT
c) TTGACA.................".................TATAAT
d) CTGACA.................".................CATAAT
sequenza consenso: TTGACa....................TAtAaT
Indicare quale delle seguenti palindromi è imperfetta
ATGCAT
TACGTA
ATGCTA
TACGAT
TTACAACCCTGTAA
AATGTTGGGACATT
Scrivere la sequenza di un ipotetico terminatore forte riportando la
struttura che esso assume sull'RNA
5’- tcCACCGGCTGCCGaagtgtttaCGGCAGCCGGTGtttttttt - 3’
3’-agGTGGCCGACGGCttcacaaatGCCGTCGGCCACaaaaa..-5’
g
t
g
a
a
t
t
t
a
G C
C G
C G
G C
T A
C G
G C
G C
C G
C G
A T
tcC GUUUUUU
La sequenza sotto riportata rappresenta un terminatore della trascrizione.
1) Indicare se si tratta di un terminatore forte o debole motivando la risposta
2) riportare la struttura che tale sequenza assume una volta trascritta
GAACTCTAGCCCGGCTTAGCCxxxxxxxxxGGCTAAGCCGGGCTTTATATTTT
CTTGAGATCGGGCCGAATCGGxxxxxxxxxCCGATTCGGCCCGAAATATAAAA
Struttura dei geni batterici
rRNA tRNA
attivazione degli aminoacidi
formazione
dell’aminoacil-AMP
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N-formil-metionil-tRNA
(tRNA iniziatore nei batteri)
(archea metionil-tRNA)
Sintesi proteica: fasi di inizio
•Interazione sub. minore del ribosoma con mRNA
(complementarità rRNA16S e sequenza SD)
•Legame del tRNA iniziatore (N-formil-metionina) alla
tripletta di inizio AUG
• legame sub. maggiore del ribosoma 50S
Fattori di inizio (IF-1, IF-2,
IF3)
GTP per fornire energia
tRNA iniziatore
Interazione sub minore +
mRNA (16S + sequenza
SD)
SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO: legame con il 16S
della sub. minore del ribosoma
rRNA 16S
SD
Tripletta di
inizio AUG
Sequenza
codificante
Ribosoma:
sito A = sito “accettore” (interazione con tRNA carico)
Sito “P” = formazione del legame peptidico con l’aa “nuovo”
Sito “E” = sito di uscita del tRNA “scarico”
-Legame aa2-tRNA al
sito A
-Legame aa1 (sito P)
con aa2 (sito A)
Legame peptidico tra il gruppo NH2
dell’aa “nuovo” (sito A) e il gruppo
COOH dell’aa precedente (sito P).
Il peptide si accresce di un aa.
Il tRNA del sito P si “scarica” e si
allontana (sito E).
Il ribosoma trasloca e il tRNA
che porta la catena di aa si
troverà nel sito P.
Il sito A è vuoto e presenta una
nuova tripletta per il legame
con il corrispondente tRNA
carico
La traslocazione è catalizzata
dall’idrolisi del GTP.
La formazione del legame
peptidico non richiede altra
energia perche il legame tra
tRNA e aa è ad alta energia
TERMINAZIONE DELLA SINTESI
PROTEICA
UAA, UGA, UAG = codoni di stop
(non codificanti)
RF = fattori di rilascio
Accoppiamento trascrizionetraduzione (procarioti)
RNA +
ribosomi
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DNA
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1 prodotto
2 o più prodotti
gene
operone
operone: insieme di più sequenze codificanti
controllate da un unico promotore
promotore
SD
SD
SD
Regolazione dei geni batterici
• a livello trascrizionale, con un controllo che può riguardare l’inizio della
sintesi dell’mRNA o la terminazione precoce del processo
• a livello traduzionale, con meccanismi che riguardano principalmente la fase
di inizio del processo
geni regolati negativamente
espressione
inducibile
REPRESSORE
sito
operatore
geni regolati negativamente
espressione
reprimibile
REPRESSORE
geni regolati positivamente
Esempio: l'operone lacZYA
ENZIMI PER L’UTILIZZO DEL LATTOSIO
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espressione inducibile
(LATTOSIO = INDUTTORE)
RBS
REPRESSORE
(LacI)
REPRESSORE
INATTIVO
INDUTTORE
(lattosio)
OPERONE LAC
TRASCRITTO
Crescita con glucosio e lattosio
La presenza del glucosio
inibisce l’espressione
dell’operone
glucosio
lacZYA non si esprime
glucosio + lattosio
lacZYA si esprime a livelli molto bassi
lattosio
lacZYA si esprime a livelli alti
la presenza di glucosio ha un effetto negativo sull'espressione di lacZYA
+ glucosio =
bassi livelli
intracellulari
di cAMP
- glucosio =
alti livelli
intracellulari
di cAMP
lacZYA necessita di un
attivatore = proteina
CAP (o CRP) legata al
cAMP
RBS
GLUCOSIO
ASSENTE
Il P destinato al
glucosio attiva
l’adenilato ciclasi
(alti livelli di cAMP)
CRP
ATTIVO
AMP CICLICO
REPRESSORE ATTIVO
(-lattosio)
PROTEINA CAP
REPRESSORE INATTIVO
(+lattosio)
RNA pol.
-LATTOSIO:
Repressore attivo
Trascrizione repressa
AMP CICLICO
REPRESSORE ATTIVO
(-lattosio)
PROTEINA CAP
REPRESSORE INATTIVO
(+lattosio)
RNA pol.
+LATTOSIO -GLUCOSIO :
Repressore inattivo
cAMP alti livelli
Proteina CAP attiva
Trascrizione alta
(utilizzo del lattosio)
RNA pol.
AMP CICLICO
REPRESSORE attivo
(-lattosio)
PROTEINA CAP
REPRESSORE INATTIVO
(+lattosio)
+LATTOSIO + GLUCOSIO
Repressore inattivo
cAMP basso
Proteina CAP inattiva
Trascrizione bassa
(viene usato prima
tutto il glucosio)
AMP CICLICO
REPRESSORE ATTIVO
(-lattosio)
PROTEINA CAP
REPRESSORE INATTIVO
(+lattosio)
RNA pol.
- lattosio: REPRESSORE ATTIVO, NO TRASCRIZIONE
+ lattosio: REPRESSORE INATTIVO, SI TRASCRIZIONE
+glucosio:NO AMPc, NO ATTIVATORE, TRASCRIZIONE BASSA (utilizzo preferenziale del
glucosio)
- glucosio: SI AMPc, SI ATTIVATORE, TRASCRIZIONE ALTA (utilizzo del lattosio)
+ Glucosio
P
EIII Adenilato
ciclasi
Glucosio
Glucosio-P
cAMP