Lezione 18 2010-11

Alessia Stell
A. Maggi Lab
13.01.2011
Le proteine terapeutiche
Le proteine
Più di 40.000 e moltissime funzioni
OPPORTUNITA’ TERAPEUTICA
Cosa sono le proteine terapeutiche
Proteine che sono state estratte da cellule umane o ingegnerizzate
in laboratorio per essere utilizzate come farmaci
(ricombinanti o non ricombinanti)
Rimpiazzare la mancanza patologica
di una proteina
(enzimi, fattori del sangue)
Rafforzare il sistema immunitario,
contro cellule tumorali o infezioni
(anticorpi monoclonali)
Più di 250 in commercio, più di 400 in trial clinico
Quali sono vantaggi/svantaggi?
VANTAGGI
• Attività mirata e altamente specifica
• Limitati effetti collaterali
• Generalmente ben tollerate
• Possono sopperire ad un difetto
genetico
• Veloce sviluppo clinico e approvazione
FDA
• Vantaggio finanziario: brevettabilità
SVANTAGGI
• Metodologie di produzione
• Contaminanti nella purificazione
• VIE DI SOMMINISTRAZIONE E
FARMACOCINETICA
Sviluppo delle proteine terapeutiche
• Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene
umane
• Proteine di II generazione modificate al fine di:
– Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità,
aumentare la penetrazione cellulare, ecc)
– Generare prodotti inattivi con funzioni diverse da quelle originarie
– Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione
• Biosimilari
Produzione di proteine terapeutiche
Proteine
poco
complesse
Proteine
complesse
BATTERI
PIANTE
• Ancora il più usato
• Ottimizzazione
• Problemi: recovery delle proteine 
secretory signal peptide – mutazione
del punto isoelettrico
• Poche modificazioni post-traduzionali
• Utilizzo in lenta crescita
• Codice regolatorio per espressione
• No modificazioni post-traduzionali
•. Grandi volumi possibili
CELLULE ANIMALI
ANIMALI TRANSGENICI
• Alti livelli di espressione e
modificazioni
• Costi elevatissimi per set-up e tempi
lunghi per FDA approval
• Alti livelli di produzione
• Espressione di proteine anche molto
complesse
• Costi bassi
• Riproducibilità della produzione
• Limite: approvazione regolatoria
Classificazione funzionale delle proteine
terapeutiche
Gruppo I
Proteine con attività enzimatica o
regolatoria
Gruppo II
Proteine con attività di targeting specifico
Gruppo III
Vaccini proteici
Gruppo IV
Proteine diagnostiche
Gruppo I
Proteine con attività enzimatica o regolatoria
Rimpiazzare una proteina carente o
non funzionale
Classiche proteine terapeutiche
Utilizzate nel trattamento di malattie metaboliche o malattie
genetiche che portano a carenza di una proteina
CLASSICO ESEMPIO: insulina nel trattamento
del diabete
Diabete: malattia caratterizzata da un alto e anormale tasso
di zuccheri nel sangue, causato dalla carenza di insulina o
resistenza alla sua azione
Insulina: prima proteina terapeutica ricombinante ad entrare
in commercio, nel 1982
Fattori di Coagulazione: altre proteine
terapeutiche molto diffuse
Emofilia: malattia genetica ereditaria che causa problemi
nell’aggregazione piastrinica e nei processi di coagulazione
Fattori di coagulazione: I fattori VIII e IX della coagulazione
possono essere ripristinati negli emofilici
Nuovi trattamenti per malattie genetiche ereditarie
Malattie come Gaucher, Fibrosi cistica, mucopolisaccaridosi,
malattia di Fabry e altre malattie metaboliche genetiche
Trattamento con enzimi e proteine che vanno a sopperire la
carenza (es. enzimi pancreatici nella fibrosi cistica, betaglucocerebrosidasi nella malattia di Gaucher)
Vantaggi delle tecniche del DNA ricombinante nella
produzione di proteine terapeutiche di classe I
Prima del DNA
ricombinante
Insulina
Betaglucocerebrosidasi
Dal 1922, purificata da
pancreas bovini e
porcini, e
somministrata come
iniezione in pazienti
con diabete
Inizialmente purificata
dalla placenta umana
Dopo il DNA
ricombinante
Problemi:
- disponibilità di pancreas
- costo della purificazione
- reazioni immunologiche
Dal 1982, prima proteina
ricombinante
commecializzata.
Produzione efficiente e
poco costosa.
Problemi:
- disponibilità di placenta
(50.000
placente/anno/paziente)
Vantaggi connessi a
minor costi, maggiore
produzione, eliminazione
rischio di malattie
trasmissibili associate
con la purificazione
Possibili
modificazioni (es,
sostituz di un aa,
che migliora le
performance)
Rafforzare un pathway già esistente
Utilizzate per stimolare, aumentare, migliorare o allungare nel
tempo un particolare meccanismo, anche se il meccanismo d’azione
dettagliato non è noto
tPA (tissue plasminogen activator) ricombinante:
L’infarto del miocardio:
- Più comune causa di morte negli USA
- dovuto ad occlusione di arterie coronarie causata dalla
formazione di un trombo di una placca aterosclerotica.
- Studi clinici hanno dimostrato che la lisi dei trombi con
attivatori del plasminogeno diminuisce la mortalita’.
Il tPA va ad ad agire nel processo di coagulazione
Il tPA agisce aumentando il processo fibrinolitico
tPA prodotto dalle cellule endoteliali
Plasmina
(enzima fibrinolitico)
Plasminogeno
(proenzima)
Nome
Alteplase
Alteplase
Reteplase
Tenecteplase
Nome
Commerciale
Activase
Catfhlo
Activase
Ratavase
TNKase
Casa
Produttrice
Genentech
Genentech
Boehringer
Mannheim
Genentech
Infarto acuto del
miocardio (AMI)
con aumento della
funzione
ventricolare in
seguito all’evento
Riduzione della
mortalità associata
all’infarto del
miocardio
acuto(AMI)
Uso
terapeutico
Infarto
acuto del
miocardio
(AMI)
Ripristino della
funzionalità
cateteri vascolari
Proteine terapeutiche di questo gruppo
possono essere impiegate nella IVF
IVF (in vitro fertilization): fertilizzazione della cellula uovo
con lo spermatozoo in vitro.
FSH (follicle-stimulating hormone): stimolo per oociti
HCG (human chorionic gonadotropin): per promuovere la
rottura del follicolo
Eritropoietina ricombinante
Anemia e sindrome mieloplastica: presenti spesso nel caso
di trattamenti chemoterapici che colpiscono le cellule del
midollo osseo
Eritropoietina: ormone secreto dai reni che stimola la
produzione di eritrociti da parte del midollo osseo
Fornire una nuova funzione o
attività
Proteine non umane presenti in natura sono utilizzate come
trattamenti terapeutici per le patologie umane  uso razionale
Esempi dell’uso terapeutico di proteine esogene
Papaina: proteina estratta dalla papaya usata per accelerare
la riparazione delle ferite e la guarigione delle ustioni
Irudina: proteina prodotte dalle ghiandole salivari delle
sanguisughe (Hirudo medicinalis), ed è un potente inibitore
della trombina (funzione anticoagulante)
Gruppo II
Proteine con attività di targeting specifico
Interferire con una specifica
molecola o meccanismo
Sfruttano la fine specificità di binding degli ANTICORPI
MONOCLONALI; usate nel trattamento di patologie infiammatorie o
tumori
Struttura degli anticorpi
Parte di riconoscimento dell’antigene; nelle
IMMUNOADESINE esso è sostituito con siti di
binding a recettori di membrana
Fc: fragment crystallizzable
Riconosciuto dalle cellule del sistema
immunitario  “tagga” le cellule che devono
essere distrutte o eliminate
Tipi di anticorpi
Murino
Chimerico
Umanizzato
Umano
Alta immunogenicità;
Interazioni deboli con
le proteine del
complemento 
poco efficiente;
Bassa emivita.
Dominio variabile
murino e dominio
costante umano;
Riduce
immunogenicità e
aumenta emivita
Con regione
ipervariabile murina e
restante umana
(95%). A volte però
meno efficaci
Completamente
umani, prodotto
attraverso phage
display o topi
transgenici
Nomenclatura degli anticorpi
Target site of antibody
Source of antibody
o(s)
bone
u
human
vi(r)
viral
o
mouse
ba(c)
bacterial
a
rat
li(m)
immune
e
hamster
le(s)
infectious lesions
i
primate
ci(r)
cardiovascular
xi
chimeric
mu(l)
musculoskeletal
zu
humanized
ki(n)
interleukin as target
axo
rat/murine hybrid
co(l)
colonic tumour
me(l)
melanoma
ma(r)
mammary tumour
go(t)
testicular tumour
go(v)
ovarian tumour
pr(o)
prostrate tumour
tu(m)
misc tumour
neu(r)
nervous system
tox(a)
toxin as target
fu(ng)
fungal
Es.
TRAS-TU-ZU-MAB
Proteine di classe II che hanno TNFalfa come
bersaglio – terapia immunogenica
TNF-a: citochina implicata nei processi infiammatori
sistemici; stimola le reazioni di fase acuta. La sua
deregolazione è implicata in diverse patologie, inclusi alcuni
tumori
Immunoadesine
ETANERCEPT:
Proteina di fusione tra TNFalpha receptor
e regione Fc dell’IgG
Lega l’eccesso di TNFa nel plasma,
marcandolo per essere eliminato dal
sistema immunitario.
Terapia per artrite e psoriasi
Anticorpi monoclonali
INFLIXIMAB - ADALIMUMAB:
Anticorpi monoclonali contro TNFa
Terapia per artrite reumatoide, Morbo di
Crohn.
Proteine terapeutiche di classe II nella terapia
oncologica
Due meccanismi
Aumento dell’immunogenicità
RITUXIMAB:
Lega la proteina transmembrana CD20
espressa sulle B-cells
Il legame stimola la risposta immunitaria. Più del
90% delle B-cell dei linfomi non-Hodgkin’s
esprime in maniera specifica CD20 terapia
specifica.
CETUXIMAB:
Lega EGF receptor e stimola la risposta
immuno-mediata.
EGFR è espresso sulle cellule di alcuni tipi di
tumori, come il carcinoma del colon-retto e
tumore del collo
Attivazione di pathways
intracellulari
TRASTUZUMAB:
Lega il recettore HER2 sulle cellule
tumorali della mammella.
Sebbene contenga la Fc region che stimola la
risposta immunitaria, la sua azione sembra
indurre pathways di segnalazione intracellulare
che portano al blocco della cdrescita e
all’inibizione dell’angiogenesi
RITUXIMAB MODIFICATO:
Modificazioni nella Fc  stimolo
dell’apoptosi
Proteine terapeutiche di classe II nella terapia
di altre condizioni patologiche
Nei trapianti d’organo: per ridurre i fenomeni di rigetto. Es.
BASILIXIMAB, DACLIZUMAB: inibiscono l’attivazione dei linfociti
IL-2 mediata poiché legano IL2 receptor
Nelle infezioni da HIV: Es. ENFUVRITIDE: immunoadesina
costituita da un peptide di 36 aa che inibisce l’entrata di HIV
nella cellula ospite + riconoscimento per gp120 (proteina
dell’envelope di HIV)
Nel trattamento di asma irresponsiva a normali trattamenti:
Es. OMALIZUMAB: lega il recettore si mastociti e basofili nei
polmoni, riducendo il rilascio di mediatori infiammatori
Delivery di altri composti o proteine
al sito target
Sfruttano la fine specificità di binding degli ANTICORPI
MONOCLONALI per fare delivery di altri composto, sostanze,
medicinali.
Area in grande sviluppo
Tipologie di anticorpi di delivery
Cellula
tumorale
Coniugati anticorpo-farmaci chemioterapici
Agenti citotossici e
chemioterapici
Chemiotereapia tradizionale
Associazione con mABs
L’associazione con anticorpi che
targettizzano le cellule tumorali  il
Non sono tumore-specifici, e si basano
solo sul concetto che le cellule a più alta
proliferazione (quelle tumorali, ma non
solo) sono più sensibili alla citotossicità.
EFFETTI COLLATERALI  dati a dosi
sub-optimali
farmaco è internalizzato solo nelle cellule
tumorali attraverso internalizzazione
recettore-mediata.
Unico approvato:
GEMTUZUMAB: lega le proteine CD33
espresse sulle cellule tumorali e rilascia
OZOGAMICINA, un composto citotossico
Coniugati proteina-tossine e
radioimmunoconiugati
Tossine coniugate a proteine
Radioimmunoconiugati
Le tossine sono generalmente enzimi che
Le tossine sono generalmente enzimi che
esercitano la loro funzione citotossica
all’interno della cellula; in molti casi anche
una sola molecola trasportata nel giusto
compartimento cellulare è un grado di
uccidere la cellula.
Possono essere coniugati ad anticorpi o ad
altre proteine
esercitano la loro funzione citotossica
all’interno della cellula; in molti casi anche
una sola molecola trasportata nel giusto
compartimento cellulare è un grado di
uccidere la cellula.
Possono essere coniugati ad anticorpi o ad
altre proteine
Es. DENILEUKIN DIFTITOX (unico
approvato FDA): frammenti di tossina
difterica fusi con Interleuchina-2, per
trattamento del linfoma cutaneo
refrattario
Es. DENILEUKIN DIFTITOX (unico
approvato FDA): frammenti di tossina
difterica fusi con Interleuchina-2, per
trattamento del linfoma cutaneo
refrattario
Gruppo III
Vaccini
Protezione contro agenti esterni
patogeni
Sfruttano le caratteristiche immunogeniche delle proteine per
l’applicazione come profilassi nella protezione di agenti esterni.
Area in grande sviluppo, per ora molto limitata
Esempi di vaccini proteici
Vaccino per Epatite B: creato producendo con ta tecnica del
DNA ricombinante gli antigeni di superficie del virus, delle
proteine non infettive che scatenano la reazione immunitaria.
Vaccino per HPV (human papilloma virus): recentemente
approvato, sfrutta proteine del capside per dare protezione al
virus, e anche contro il tumore alla cervice ad esso correlato
Trattamento di disordini
autoimmuni
Protezione contro un sistema immunitario iper-reattivo che
riconosce come agenti estranei proteine endogene
Vaccini contro tumori
Ancora no approvati da parte dell’FDA, ma alcuni in
sperimentazione clinica.
Risente molto delle nuove scoperte della medicina di base, che
fornisce target per la vaccinazione
Vaccino contro linfoma non-Hodgkin’s
Nei linfomi non-Hodgkin’s si ha una proliferazione maligna
delle cellule B, che mostrano tutte un unico anticorpo
specifico sulla loro superficie.
La regione idiopatica può quindi essere individuata e clonata,
ed espressa in piante di tabacco con la tecnica del DNA
ricombinante, per ottenere un antigene tumore-specifico
utilizzabile per la vaccinazione del paziente.
6-8 settimane per ottenere il vaccino dalla biopsia.
Problematiche connesse allo sviluppo
di proteine terapeutiche
Perché le proteine sono particolari rispetto a
composti di natura chimica?
• Ordini di grandezza più grandi rispetto a
farmaci tradizionali
• Strutture secondarie e terziarie 
suscettibili a degradazione fisica e chimica
•Immunogeniche
Problemi di solubilità e stabilità
• Grosse molecole con proprietà idrofiliche
e idrofobiche
• Suscettibili a proteasi e a meccanismi di
clearance
AGGIUNTA DI POLIMERI:
Es. PEG (Polyethylene glycol)
• low molecular weight
• solubile in acqua
• polimero non ionico
• coniugato in multiple copie
Prolunga la circolazione di proteine terapeutiche o ne altera
le proprietà (es. delivery ai tumori)
Problemi di immunogenicità
• Tutte le proteine esogene (umane e non
umane) sono riconosciute dal sistema
immunitario come “straniere” e scatenano
la risposta immunitaria
•Questa risposta immunitaria può alterare
le proprietà della proteina terapeutica o
essere dannosa per il paziente
Enzimi e proteine del Gruppo I: possono scatenare reazioni
immunitarie
Anticorpi: soprattutto quelli murini, ma anche quelli umani
Problemi per trovare la via di
somministrazione adatta
VIA PARENTERALE:
Rappresenta la via d’elezione
VIA ORALE:
Ad oggi praticamente non utilizzabile, ma desiderabile
VIA NASALE, POLMONARE, TRANSDERMICA:
Vie alternative non invasive percorribili
Limiti della via orale
ELEVATA DEGRADAZIONE
Endopeptidasi presenti a livello intestinale
(pepsina, tripsina, chimotripsina, elastasi)
Esopeptidasi (carbossipeptidasi A e B)
SCARSO ASSORBIMENTO
Molecole di grande dimensioni
Assenza di meccanismi di trasporto attivo
Struttura ciclica e proprietà lipofiliche
Via Parenterale
La scelta della via endovenosa,intramuscolare,
sottocutanea e intraperitoneale dipende dall’emivita
della proteina stessa e dalla concentrazione ematica
necessaria per ottenere l’effetto farmacologico
Es: l’emivita del TPA è di pochi minuti, mentre quella di un
anticorpo monoclonale è di alcuni giorni
Per aumentare l’emivita
si possono operare
modificazioni nella proteina
(mutagenesi)
si può passare dalla somministrazione per via i.v. a quella i.m.
o s.c. tenendo conto che Dopo iniezione s.c. il farmaco può entrare nei capillari
linfatici e non utilizzare il torrente circolatorio dando una
differente biodisponibilità
Vie alternative
Per la via nasale solo 3 proteine terapeutiche somministrate
Per la via polmonare, aerosol di insulina
Referenze
• Leader B, Baca QJ, Golan DE. Protein therapeutics: a summary and
pharmacological classification. Nat Rev Drug Discov. 2008 Jan;7(1):21-39.
• Brown LR. Commercial challenges of protein drug delivery. Expert Opin
Drug Deliv. 2005 Jan;2(1):29-42
• Schrama D, Reisfeld RA, Becker JC. Antibody targeted drugs as cancer
therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006 Feb;5(2):147-59.