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La Malattia di Alzheimer
Malattia di Alzheimer
Principale malattia neurodegenerativa
13% sopra 65 anni
50% sopra 85 anni
Esame post-mortem:
A.
B:
grovigli neurofibrillari e
-amiloide sotto forma di placche.
Malattia di Alzheimer
Esordio:
- AD INSORGENZA PRECOCE (<65 anni), più rara
- AD INSORGENZA TARDIVA, più diffusa
Eziologia:
- fattori genetici 5-10%
- sporadica, multifattoriale
Complesso: non c’è nessun singolo (o semplice) meccanismo di
trasmissione che giustifica la sua ereditarietà;
Eterogeneo: le mutazioni e i polimorfismi nei geni multipli sono coinvolti
insieme a fattori non genetici;
Dicotomico: le mutazioni dell’AD familiare ad insorgenza precoce sono:
- rare,
- altamente penetranti,
- A trasmissione autosomica-dominante,
- Mutazioni in:
presenilin 1, amyloid precursor protein, presenilin 2
 early-onset familial AD
- Polimorfismi in Apolipoproteina E
 associati alla forma sporadica
Aspetti Neuropatologici
Alterazioni morfologiche quantitative:
- riduzione di peso e di volume dell’organo
- dilatazione cavità ventricolari
- ampliamento dei solchi e delle
scissure a livello della corteccia
- maggiore atrofia
Patologia della malattia di Alzheimer
PLACCHE DI AMILOIDE:
depositi amorfi extracellulari di proteina -amiloide (A)
sotto forma di placche
GROVIGLI NEUROFIBRILLARI:
intreccio intracellulare
di neurofibrille formate da proteina TAU anomala
Placche senili
Le placche senili sono distinte in tre tipi:
1. CLASSICHE: sono accumuli extracellulari, costituiti da un nucleo
centrale di -amiloide, circondato da un anello di neuroni distrofici,
microglia e astrociti
2. DIFFUSE: sono una forma preliminare rispetto alle classiche e
localizzate in aree celebrali non sintomatiche dell’AD
3. BRUCIATE: sono un nucleo isolato di amiloide
Placche di amiloide
Sono ammassi di sottili filamenti (7-10 nm) che si formano nello spazio extracellulare
nel cervello dei malati di AD.
Sono costituiti da una forma insolubile del peptide che deriva dalla proteina
precursore del -amiloide (APP) e queste placche possono avere un nucleo denso
centrale.
Una porzione variabile di tali placche contengono anche altre molecole proteiche e
non, e possono essere associate a cellule non neuronali e a processi neuritici
anormali.
Colorazione rosso congo
Causa dell’accumulo delle Placche
Due cause principali dell’accumulo delle placche:
1. Forme dominanti della malattia associate alla disfunzione dei geni
che controllano il metabolismo della proteina amiloide: a-, -, and gsecretasi e preseniline 1 e 2
2. Forme non dominanti della malattia (incluse le forme sporadiche) che
coinvolgono i meccanismi della rimozione della A.
Il precursore dell’amiloide
Blu  PS1 Verde  APP
Rosso  Mutazioni
Giallo  sito attivo
La proteina precursore dell’amiloide viene normalmente degradata per l’azione di una
serie di proteasi, chiamate secretasi: a-, -, e g-secretasi che tagliano la proteina in
sequenze specifiche (vedi forbici)
Queste proteasi sono sotto il controllo di due altre proteasi: le preseniline 1 e 2
Mutazioni nelle preseniline, a-, -, e g-secretasi o nella APP stessa determinano
l’accumulo extracellulare di A (vedi aa rossi) sono causa di malattia.
(A) Structure and topology of APP.
(B) The fine structure around the Aß domain, secretase cleavage sites, and locations of some selected
familial AD missense mutations.
Rimozione dell’amiloide
Ruolo dell’ApolipoproteinaE (ApoE)
Proteina plasmatica implicata nel trasporto del colesterolo
Nel SNC interviene nei meccanismi di crescita e riparazione dopo un danno
Nell’AD la ApoE è legata alle placche di A e ai grovigli neurofibrillari
ApoE inibisce la formazione di fibrille di A, ma perde efficacia se associata ai lipidi
I peptidi amiloidi interagiscono direttamente con ApoE legandovisi e potrebbero
essere poi trasportati all’interno delle cellule neuronali via recettori per ApoE
Nei cervelli di soggetti sani ApoE si lega e sequestra A in modo più efficiente che
in quelli dei malati di AD
La deplezione di colesterolo comporta una riduzione nella produzione e nel rilascio
di A
Aggregazione promossa per aggiunta di ioni metallici, ApoE facilita o attenua il
processo a seconda del metallo
Ruolo dell’amiloide nei neuroni
L’amiloide agisce attraverso recettori sulla membrana cellulare,
stimolando cambiamenti all’interno della cellula:
1.
anormale fosforilazione di tau,
2.
aumento dello stress ossidativo;
L’amiloide stessa è in grado di generare radicali liberi, che
provocano
danni
alle
membrane,
con
conseguente
degenerazione;
Altri studi hanno mostrato che antiossidanti non proteggono i
neuroni, nei saggi di tossicità dell’amiloide;
Cambiamenti mitocondriali dell’AD portano ad una fosforilazione
ossidativa aberrante;
L’amiloide può causare danni al DNA e/o dare origine ad
apoptosi;
Patologia neurofibrillare
Sono anormali strutture filamentose che includono filamenti a doppia elica e
filamenti lineari che contribuiscono alla formazione di matasse nei corpi
cellulari .
Questi filamenti sono altamente insolubili e permangono nello spazio
extracellulare anche dopo la morte del neurone.
Grovigli neurofibrillari
Colorazione con Sali
d’argento
I grovigli neufibrillari sono dovuti a fasci di filamenti insolubili che derivano da alterata
fosforilazione delle proteine TAU, associate al citoscheletro dei neuroni, che si
accumulano nel corpo neuronale
L’iperfosforilazione riduce l’affinità delle TAU per i microtubuli causando una
perdita di stabilità nel neurone e può portare alla modificazione del metabolismo
dell’APP
Queste masse neurofibrillari si trovano principalmente:
A.
nelle cellule piramidali dell’ippocampo e
B.
nei piccoli neuroni piramidali della corteccia fronto-temporale
Causano una perdita della memoria recente
All’inizio le matasse neurofibrillari sono intracellulari e non c’è
un’apprezzabile perdita di neuroni;
quando si sviluppano le placche e i grovigli si diffondono alla
neocorteccia, i neuroni degenerano e lasciano grovigli extracellulari.
Individui non dementi, con depositi di -amiloide nella
neocorteccia possono avere deficit cognitivi
quindi
Stadio precoce di AD
Forse fase preclinica, prevista dalla cascata patologica
dell’AD
Lo sviluppo delle placche nelle aree
neocorticali precede la patologia
neurofibrillare e la demenza clinica
Modelli in vitro per la
Malattia di Alzheimer
Aβ(25-35) is frequently used in investigating Aβ properties as a less expensive and more easily handled
substitute for the native full-length peptide, Aβ(1-42). Indeed, Aβ(25- 35) mimics the toxicological and
aggregation properties of the full-length peptide, though these characteristics are enhanced; i.e., the
shorter peptide is more toxic to cultured neurons, exhibits earlier toxicity, causes more severe membrane
protein oxidation, and aggregates faster than the native Aβ(1-42). The amyloid fibrils were obtained
dissolving the Aβ(25-35) stock solution in FBS-free medium at pH 7.4 and incubating Aß (25-35)
stock solution at 37°C for 8 days
ThT-Based Fluorimetric Assay
The amyloid polymerization status
was checked by the thioflavin T (ThT)
fluorescence method before each
treatment. ThT binds specifically to
amyloid, and such binding produces a
shift in its emission spectrum and an
increase in the fluorescence signal,
which is proportional to the
amount of amyloid formed .
Fluorescence was monitored at
excitation wavelength of 450 nm and
emission of 485 nm by
spectrofluorometry,
SH-SY5Y 12 CELL LINE
Le linea cellulare SH-SY5Y è il terzo subclone della linea cellulare SK-N-SH
ottenuta, nel 1970, dalla biopsia del midollo osseo di una paziente affetta da
neuroblastoma originato dai gangli simpatici adrenergici.
L’SH-SY5Y ORIGINA da un clone delle SK-N-SH con caratteristiche neuronali.
NOTA: il processo di clonaggio è essenzialmente una selezione artificiale di cellule
singole o gruppi di cellule che esprimono un particolare fenotipo di interesse
Le SK-N-SH contengono cellule con tre differenti fenotipi:
NEURONALE (N)
CELLULE DI SCHWAN (S)
INTERMEDIE (I)
Le SH-SY5Y sono cellule con fenotipo NEURONALE (N)
Le SH-SY5Y sono cellule con fenotipo
NEURONALE (N)
SH-SY5Y CELL LINE
Terreno di crescita:
90% RPMI 1640
10% HORSE SERUM
Substrato:NO
Glutamina 20mM cf
2
•Il tempo di duplicazione delle SH-SY5Y è di circa 2-3 giorni.
•Una buona proliferazione è ottenuta cambiando il terreno ogni 2-3 giorni (metà terreno).
•Quando le colture raggiungono la confluenza devono essere subcoltivate ad una proporzione
di 1:3
ACIDO RETINOICO
SH-SY5Y CELL LINE
NON DIFFERENZIATE
DIFFERENZIATE
BDNF, NGF
N2 SUPPLEMET
Phorbol ester
STAUROSPORINE
•Blocco della proliferazione
•Crescita dei neuriti
•Acquisizione di proprietà elettriche
Differenziamento delle sh-sy5y
Densità cellulare: la densità di semina corretta deve essere compresa tra 5-10 x 10 cell/cm
3
2
Substrato: poli-d-lisina
Terreno di coltura: aggiunta al terreno di coltura degli agenti differenzianti (7-12 giorni). Per assicurare
la massima biodisponibilità di del differenziante il terreno verrà cambiato ogni due giorni.
Differenziamento delle SH-SY5Y
MAP2
GAP43
NeuN
SINAPTOSINA
ACIDO RETINOICO,
N2 SUPPLEMET,
Phorbol ester
Fenotipo colinergico
Fenotipo adrenergico
EFFETTI DIFFERENZIANTI DELL’ACIDO RETINOICO E DEGLI ESTERI DEL
FORBOLO
ACETILCOLIN
TRANSFERASI
RA
VESCICULR
MONOAMMINE
TRANSPORTER
NPY
TH, NPY
TPA
NA
Attività della
Ornitina
decarbossilasi
(enzima rate-limiting
per la biosintesi delle
poliammine)
TGF-
NA
BMB2
EFFETTI DIFFERENZIANTI DELLE STAUROSPORINE
STAUROSPORINE
Fenotipo DOPAMMINERGICO
DAT
TH
RA+ COLESTEROLO +TPA
Fenotipo DOPAMMINERGICO
DAT
TH
CELLULE DI
CONTROLLO
CELLULE DI TRATTATE CON
PLACCHE DI Aβ
Aβ(25-35) Treatments in rat neurons
For acute experiments neurons grown for 5 DIV, were treated with 12.5 µM Aβ25-35 for 24h,
then collected and examined.
For chronic experiments, 5 DIV cultures were treated every day for 14 days with sublethal doses
(0.5µM) of Aβ25-35 in order to simulate Aβ gradual accumulation.
Aβ(25-35) Treatments in human neuronal cells
SH-SY5Y cells were seeded in monolayer culture and maintained for 24h in RPMI-1640
medium supplemented with 10% FBS. In order to subject cells to neuronal differentiation,
the medium were replaced with FBS-free differentiating medium containing N2 supplement
and the cells were cultured for 7 DIV
Neuronal primary cultures were generated from Sprague–
Dawley rat embryos at 16–19 days of development. All
experiments have been carried out in accordance with the
European Community Council Directive of 24 November
1986/86/609/EEC. Formal approval for the described
experiments was obtained by the Italian Ministry of Health
(D.L.vo 116/92) and all efforts were made to minimize the
number of animals used and their suffering. Brains were
removed from fetuses and cortices were dissected under a
stereomicroscope. The tissue was collected under sterile
conditions and dissociated enzymatically with papain (20 U/ml)
and then mechanically (10–12 pipette aspirations). Dissociated
cells were resuspended in DMEM supplemented with 10%
horse serum and seeded at 2x105 cells/cm2 on poly-D-lysinecoated coverslips (15g/ml) and on precoated 60 mm well dishes.
The cultures were maintained at 37 °C in 95% air/5% CO2 for
24 h, then the medium was replaced with serum-free
DMEM/F12 supplemented with 5 μg/ml insulin, 100 μg/ml
apotransferrin, 1mM pyruvate, 2%w/v BSA. BSA was dialyzed
three times against Elliot buffer (122 mM NaCl, 4.8 mM
KCl,0.4 mM KHPO, 1.2 mM MgSO , 1.3 mM CaCl , pH 2 .4.
7.4) (Elliot 1969) for 24 h and filtered through a 0.2-mm filter
before use. Cultures maintained in these conditions reach
complete maturation in 6–7 days in vitro, characterized by both
electric and neurochemical mechanisms completely efficient,
and reproducing the physiological conditions in vivo (Banker &
Goshin 1991).
Modelli in vitro per la Malattia
di Alzheimer mediante
deprivazione di NGF
•I meccanismi di segnale indotti da BDNF e NGF sembrano avere un ruolo chiave nella patologia
dell’AD:
• La via di segnale BDNF implicata particolarmente nel processo di learning e memory sembrerebbe
essere inibita durante prima fase della patologia (EARLY ONSET) dalla presenza di oligomeri non
ancora aggregati in placche.
•La via di segnale dell’NGF e in particolare la sua inibizione porta alla overproduzione di Aβ
PC 12 CELL LINE
Le linea cellulare è stata clonata a partire da feocromocitoma di ratto, originato dalla
midollare del surrene.
Questa linea cellulare esibisce proprietà fenotipiche associate al feocromocitoma e alla
controparte non neoplastica delle cellule cromaffini del surrene.
Perciò queste cellule sono in grado di sintetizzare, immagazzinare e rilasciare
CATECOLAMINE (adrenalina, noraadrenalina, dopammina).
- NGF
+ NGF
PC 12 CELL LINE
Substrato:
Terreno di crescita:
COLLAGENE: 6-10ug per cm
85% RPMI 1640
L’incubazione con la soluzione di collagene viene
effettuata per tutta la notte a temperatura ambiente. Il
giorno dopo la soluzione viene rimossa e la piastra
viene lasciata sotto cappa ad asciugare.
10% HORSE SERUM
5% FETAL BOVIN SERUM
2
•Il tempo di duplicazione delle PC12 è lento circa 3-4 giorni.
•È preferibile usare le piastre di coltura piuttosto che flask.
•Una buona proliferazione è ottenuta cambiando il terreno ogni 2-3 giorni (metà terreno).
•Quando le colture raggiungono la confluenza devono essere subcoltivate ad una proporzione
di 1:3 o 1:4
•Valutazione di risposta all’NGF
Modelli sperimentale mediante
deprivazione di NGF
Le cellule PC12 sono seminate in piastre Petri e differenziate in neuroni in
presenza del 10% di siero di cavallo, 5% di siero fetale bovino e 50ng/ml di NGF
per 10-12 giorni
La deprivazione viene effettuata togliendo il terreno di coltura e aggiungendone
uno senza siero e NGF per 2 giorni
• La deprivazione di NGF porta alla iperproduzione di placche di β amiloide responsabili della
morte apoptotica delle cellule ( il trattamento con anticorpi specifici per l’ β amiloide protegge
dalla morte)
La presenza delle placche è stata verificata mediante colorazione con ThT, WB e spettroscopia
di massa).
•La produzione delle placche e l’apoptosi dipendono dall’inattivazione del recettore per l’NGF
TrkA in seguito a deprivazione di NGF ( il trattamento con un inibitore di TrkA , K252-a, in
presenza di NGF, ha gli stessi effetti della sua deprivazione.
•La iperproduzione di placche di β amiloide dipende da un abberrato processamento dell’ AβPP
(inibendo la α e β- secretasi la produzione di β amiloide e la morte apoptotica sono ridotte.
Stesso risultato si ottiene silenziando parzialmente l’ AβPP
Generazione di neuriti mediante trattamento con NGF
Densità cellulare: ad un’alta densità cellulare la crescita dei neuriti è inibita, a bassa densità le cellule non
crescono bene, la densità di semina corretta deve essere compresa tra 2,5-10 x 10 cell/cm
Substrato: collagene
4
2
Terreno di coltura: aggiunta al terreno di coltura di 50ng/ml di NGF,il trattamento con NGF deve essere
fatto per 10-12 giorni. Per assicurare la massima biodisponibilità di NGF il terreno verrà cambiato ogni
due giorni.
PC 12 CELL LINE
- NGF
+ NGF
•Blocco della proliferazione
•Crescita dei neuriti
•Acquisizione di proprietà elettriche
Le PC12 sono dei veri e propri
neuroni?
Uso delle pc12 in neurobiologia
•PC12 come modello per la neurosecrezione
•PC12 come modello per la neurodegenazione
•PC12 come modello per il differenziamento neuronale
PC12 e neurodegenerazione
+ NGF
NGF
Overproduzione del peptide A
Strutture di beta aliloide aggregate
intra ed extracellulari
Progressiva morte apoptotica
Per indurre l’apoptosi verranno lavate tre
volte in PBS ed una in terreno senza siero.
Successivamente alle cellule sarà aggiunto
terreno senza NGF.
LE PLACCHE SI FORMERANNO IN 48H
What is Parkinson’s Disease?
• Progressive loss of
dopaminergic neurons
in the substantia nigra
• Reduction in SN and
striatal DA
• Increase in glial cells
in the SN
• Neuromelanin (DA
pigment) loss
• Lewy bodies
La malattia di PARKINSON è caratterizzata dalla perdita di neuroni
dopaminergici al livello della subsantia nigra.
Diagnosis
•
•
Clinical features: Bradykinesia, resting tremors, muscle rigidity, loss of postural
reflexes, flexed posture, and the freezing phenomenon
– Parkinsonism diagnosis with 2 symptoms
Parkinsonisms:
– Primary: Parkinson’s disease (PD) – most common
• asymmetrical onset of motor symptoms
• rest tremor
• Substantial clinical response to levodopa therapy
– Secondary: drug-induced or postencephalitic parkinsonism
– Parkinson-plus syndromes - w/ other neurological features, i.e. progressive
supranuclear palsy and multiple system atrophy
– heredodegenerative disorders – parkinsonism features in a heritable
degenerative disorder (juvenile Huntington or Wilson disease)
Fahn and Sulzer, 2004
Neurotrophin Hypothesis in
Neurodegenerative (ND) disorders
• Neurotrophins promote: development,
heath, survival of neurons
– BDNF: synaptic plasticity, neuronal survival
and differentiation
• Studies suggest BDNF disruption in:
–
–
–
–
Huntington’s
Alzheimer’s
Multiple Sclerosis
Parkinson’s
MSC induction to NF-SC
Human
Mesenchymal
Stem Cells
Passaged 12-18
days
SPN
Lglutamate
dbcAMP
IBMX
N2
hEGR
hbFGF
PDGF
HRG1-β1
hbFGF
Neurotrophic factor
secreting cells
Media replaced
72 hrs later
Confirmation of neurotrophic factor secretion.
In vitro model of Parkinson’s
Serum-free
media (control)
MSC
Culture supernatant
(control)
Serum-free media
NTF-SC
Culture supernatant
(contains NTF)
Serum-free media
+ 1h
32-160 μM
6-OHDA
Cell culture. SK-N-MC neuroblastoma cells were
cultured in minimum essential medium (MEM) with
Earle's salts containing 5 mm glucose (Mediatech,
Herndon, VA), 15% fetal bovine serum (Invitrogen,
Carlsbad, CA), 50 U/ml penicillin and streptomycin,
5 mm sodium pyruvate, and nonessential amino acid
solutions for MEM (Mediatech). Media were
supplemented with 5 nm rotenone (Sigma, St. Louis,
MO) or solvent (ethanol) for up to 4 weeks. The
concentration of rotenone was chosen on the basis of
a pilot study and previous observations (Sherer et al.,
2001b). For routine culture, cells were grown in 100
mm plates, fed three times per week with control
medium or medium supplemented with 5 nm
rotenone, and passaged approximately once a week
on reaching confluence. Rotenone (5 nm) did not
alter cellular morphology or growth kinetics over the
4 week exposure period.
Huntington’s disease
Also called Huntington Chorea, affects men and women. 4 to 10 cases in 100,000 people (frequency
between 0.004% and 0.01%) .
Chorea is defined as brief, irregular, unpredictable, purposeless movements that flow
from one body part to another without a rhythmic pattern.
HD is a Hyperkinetic Disorder. The symptoms in HD are characterized by
Excessive motor activity
Involuntary movements (dyskinesias)
Decreased muscle tone
Behavioral and emotional alteration and cognitive decline, which may precede motor
abnormalities. Importance of cognitive and neuropsychological test to identify the presymptomatic carriers of the disease.
HD is a dominant autosomal inherited disease characterized by the expansion of a
triplet repeat CAG, that encodes for Glutamine, in the N-terminal domain of the
protein.
Specific localization of Basal Ganglia in a coronal section
HD is caused by selective degeneration of the
GABAergic neurons in the striatum, in particular in
the caudate
Volumetric analysis in Huntington disease (HD)
HD
Normal
Age of onset:
HD is thought to be a true dominant disorder, since homozygous carriers
of the disease are no more severely affected than heterozygous
carriers. In a normal individual, the number of CAG repeats are <36. In
HD patients, age of onset when the repeats are 46 ranges between 25 and
52 years old. However, many factors influence the onset of the disease,
such as:
Mitochondrial dysfunction
Cell death by apoptosis
Loss of neurotrophic factors
Neuron excitotoxicity
Length of the CAG repeat and onset of the disease: Inverse correlation, but
not when onset is >50 years of age.
Deposition of fibrillar proteinacious material
in Huntington’s disease
Huntington’s disease: a progressive neurodegenerative disease characterized by CAG repeats
causing glutamine expansion motifs (polyQ) in the N-terminal region of the protein huntingtin.
Onset of the disease inversely correlates with the number of CAG repeates. Huntingtin can
aggregate forming intracellular inclusion bodies that contain also proteasome proteins and
ubiquitin. Huntingtin aggregates contain -sheet structures similar to amyloid.
Huntingtin
In homo sapiens, the gene for huntingtin encodes a large, cytosolic protein, comprised of 3144 aa and
with a molecular weight of about 348 kDa.
PolyQ P
NH2
aa1
In normal individuals, PolyQ<36. In HD patients, PolyQ>36
COOH
aa3144
Processing of PolyQ, mutant huntingtin
Cdk5, Akt
COOH
PolyQ P
NH2
aa1
Cleavage by caspase 2, 3, 6
calpain
NH2
N-terminal
fragment
N-term htt forms
aggregates
C-terminal
fragment
aa3144
COOH
Modelli cellulari
•Colture mesencefaliche di
neuroni di ratto transfettate con
Hungtintina mutante
•Colture mesencefaliche di topo
R6/2