G. Valdrè

Nanobiotecnologie
mineralogiche
Giovanni Valdrè – Università di Bologna
Workshop “Minerali e salute”
Roma 14-15 Giugno 2007
INTRODUZIONE
In un ampia varietà di applicazioni biotecnologiche, chimiche e
nanoingegneristiche le reazioni hanno inizio da superfici.
La combinazione delle biotecnologie con le scienze mineralogiche ha
un gran potenziale per la generazione di substrati avanzati, la
funzionalizzazione di nanoparticelle inorganiche per mezzo di
componenti biologici ottimizzati dall’evoluzione (es. DNA come stampo
per particelle legate a oligonucleotidi).
Le proprietà elettrostatiche e topografiche delle superfici, delle
macromolecole biologiche e relativi complessi possono essere usate
per la sintesi e l’assemblaggio di componenti organici ed inorganici.
Importanza dello studio del potenziale di superficie a livello
nanometrico.
Imparando dalla natura
La natura offre nanopotenziali minerali confinati
“going back to nature”
Substrati sintetici
per nanobiotecnologie
Substrati naturali?
Campi di applicazione dei substrati
Patterning di biomolecole su superfici solide per lo sviluppo di:
• substrati per analisi enzimatiche massive
• interazione DNA-enzimi
• biosensori miniaturizzati ed integrati (sensoristica,
manipolazione, catalisi)
• bioelettronica (nanoelettronica molecolare)
• organizzazione di nanoparticelle guidata da biomolecole
(conducting nanowires and quantum dots devices)
• legame selettivo di materiali componenti.
Campi di applicazione dei substrati
enzimatici
•
Microbiologia: rilevazione contaminazioni microbiche
di cibo, acqua potabile
•
Diagnostica clinica: rilevazione livelli enzimatici dei
fluidi corporei e relative condizioni cliniche del paziente
•
Biologia molecolare: supporti per clonazione Dna
Esempi di
substrati sintetici, patterning
DNA sliding along RNA polymerase
DNA wrapping
(nucleosome-like structure)
50 nm
DNA length:
1001 base pairs
Guthold, M. et al. Biophys. J. 1999, 77(4)
Beloin, C. et al., J. Biol. Chem. 2003, 278(7)
Substrati naturali
Fillosilicati
Studiati e osservati a livello nanometrico tramite AFM
Simulato il potenziale elettrostatico tramite metodi numerici “multiphysics”
Nanotecnologie
Microscopio a Forza Atomica
amplificatori
detector
laser
PC
nanopunta
scanner
Effetti della deposizione del DNA su
substrati fillosilicatici atomicamente
piani
DNA
Importanza Biologica
Trasporta
l‘informazione genetica
necessaria alla
trasmissione dei
caratteri ereditari.
(Ma può essere anche un veicolo per il nanopatterning sui substrati)
Alcune forme di DNA
S-DNA: B-form ds-DNA (double
strand) sottoposto a tensioni
> 65pN, si stira di 1.7 volte.
Studio della transizione:
B-DNAS-DNA
C. Bustamante et al., Ten years of tension: single-molecule DNA
mechanics, Nature, Vol 421 (2003)
Deposito di DNA su altri
fillosilicati e minerali a strati
Talc
Brucite
Pyrophillite
Vermiculite
Chlorite
Chlorite
3D
Chlorite
DNA surface coverage
SURFACE
DNA
% COVERAGE
SURFACE
RATIO TO
MUSCOVITE
DEPOSITED
VOLUME
(m3)/m2
VOLUME
RATIO TO
MUSCOVITE
Muscovite
7%
1
20 ·10-6
1
Biotite
42 %
6
147 ·10-6
7
Phlogopite
41%
6
145 ·10-6
7
Talc
76 %
11
387 ·10-6
20
Brucite
58 %
8
503 ·10-6
25
Chlorite
48 %
7
149 ·10-6
7
DNA surface coverage
PHENOMENOLOGICAL RULES
1. Tri-octahedral structures present higher DNA
concentration, condensation and deposition capacity
than Di-octahedral ones.
2. Tri-octahedral structures with a low mean layer charge
have greater DNA affinity than high layer charge
structures.
3. Some phyllosilicates (e.g., Chlorites, Vermiculites) can
“order” or “nanopattern” DNA.
Studio della Clorite
(Perché? Per le caratteristiche di anisotropia)
• piste nanoconfinate
• potenziale invertito alla superficie
• presenza di gradini subnanometrici
Clorite studiata
Triclinic clinochlore crystal (Space Group Cī ; IIb-4 polytype)
Bruker X8-Apex fully automated four-circle diffractometer
WDS ARL-SEMQ Microprobe
Calculated formula
[VI](Mg
2.963
Fe2+0.275 Ti0.004 Al0.977 Cr3+0.052) [IV](Si2.963 Al1.037)O10(OH7.91 F0.009)
Clinochlore according to Bayliss (1975) nomenclature
• tetrahedral sites filled with Si and Al (~25%), Fe3+ (~ 0.3%)
• octahedral TOT filled with Mg
• octahedral brucite-like layer filled with Mg and Al (~25%), Fe2+ (~3%)
• Ti, Cr, Mn found in octahedral sites
Clinocloro: SUPERFICI, ENERGIA, POTENZIALE
S
B
After cleavage, chlorite presents
simultaneously on the same specimen surface
zones of brucite (B) and zones of siloxanes
(S) with lateral sizes ranging from a few
nanometer to microns. EFM allows us to
measure the thickness of the brucite layers.
B
S
Scansione 5x5 m, in Contact Mode in aria, di DNA (1 nM) su clinocloro. Le
molecole di DNA si depositano esclusivamente sugli strati tipo brucite, ma
realizzano dei ponti fra le piste.
Condensazione e conformazione del
DNA su clorite
DNA sullo strato
positivo
Disposizione “a ponte”
con stretching del
DNA
Assenza di DNA
sullo strato negativo
Condensazione e conformazione del
DNA su clorite (osservazioni in liquido)
1m
Misure e simulazioni teoriche dei potenziali nanoconfinati
di superfici di minerali
1. Microscopia a Forza Atomica e sue derivazioni:
a. EFM
b. KPFM
c. MF-EFM
2. Simulazioni numeriche multifisiche
a.
b.
c.
d.
simulazione del potenziale di superficie (Maxwell’s laws)
forze agenti sulla nanopunta (Maxwell Stress Tensor)
deflessione elettro-meccanica (Maxwell Stress Tensor)
forze di trazione sul DNA (Forza di volume elettrostatica)
Modalità di funzionamento:
Microscopia a Forza Elettrica (EFM)
Metodo a due passi (lift)
• Modalità Statica
Force Volume
FE = kLDL
viene acquisita una matrice bidimensionale di Curve di Forza,
rappresentanti la distribuzione 3D del
campo elettrico sopra una superficie.
DL = deflessione del cantilever
Metodo a due passi (lift)
• Modalità Dinamica
Teoria delle piccole oscillazioni:
una sonda ricoperta da un sottile
film conduttivo viene fatta vibrare
meccanicamente a zlift nm da una
superficie.
A = A0cos(ω0t)
  02


kts  k L 2  1


0
f


vibrazione meccanica in lift
Metodo a due passi (lift)
Microscopia a Sonda Kelvin (KPFM):
eccitazione elettrica
Vtip = Vdc + Vaccos(ωt)
una sonda ricoperta da un sottile
film conduttivo viene eccitata
elettricamente a zlift nm da una
superficie.
1
2 C  z 
Fcap  z   Vtip  Vs 
2
z
F1cap  z  
C  z 
Vdc  Vs Vac
z
Modello Computazionale
Accoppiamento elettro-meccanico: il Tensore delle Tensioni di Maxwell
Utile per simulare la deflessione elettrostatica del cantilever e le forze elettrostatiche di
trazione del DNA da parte dei nanogradienti di potenziale del clinocloro.
La forza per unità di volume che agisce su un corpo dielettrico quando è sotto
l’influenza di un campo elettrostatico esterno è espressa da:





 0  

 0    d e
Fv  E 
E  E  e   E  E
 m 
2
2 
d m

Il primo termine è l’ordinaria forza di volume elettrostatica; il secondo termine
rappresenta una forza presente quando un dielettrico inomogeneo è immerso in
un campo elettrico; l’ultimo termine, noto come termine di elettrostrizione, da una
forza di volume per un dielettrico in un campo elettrico non omogeneo.
Osservazione della nanotopografia e del potenziale senza DNA
topography
Kelvin
Probe
potential