Metilazione del DNA

STUDIO ESPRESSIONE
GENICA
I meccanismi di controllo usati per regolare l’espressione
dei geni umani devono essere molto più complessi da quelli
utilizzati dagli altri organismi.
•Regolazione trascrizionale
•Regolazione post-trascrizionale
•Meccanismi epigenetici e controllo
dell’espressione genica a lunga distanza
Cellula umana contiene circa 30000 geni
RNA genes
Geni per proteine
Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte
di questo potenziale (˜ 5000 geni)
Geni housekeeping
metabolismo
biosintesi
membrana
istoni
ribosomali
Geni tessuto - specifici
DIFFERENZIAMENTO
CELLULARE
A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE)
UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA
Esistono molteplici livelli di regolazione
dell’espressione genica negli eucarioti
NUCLEO
Meccanismi epigenetici: controllo a lungo
DNA
raggio mediante rimodellamento della struttura
della cromatina
controllo trascrizionale: legame di
fattori trascrizionali tessuto specifici,
legame diretto di ormoni, fattori di
crescita o elementi intermedi a elementi
risponsivi di geni inducibili
Trascritto primario
(precursore)
controllo post-trascrizionale: splicing
alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessutospecifico
mRNA
controllo del trasporto
CITOPLASMA
controllo
traduzionale
traduzione
mRNA
controllo della stabilità
degradazione
PROTEINA
controllo post-traduzionale
PROTEINA attiva o inattiva
Meccanismi epigenetici
Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non
sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA.
•Metilazione del DNA;
Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo
il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della
metilazione la C della doppietta CpG.
•Modificazioni degli istoni;
Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili
cambiamenti conformazionali della cromatina.
di
Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA
La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioni
riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La
metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare,
tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale.
Quali regioni sono bersaglio della metilazione?
•I geni dei vertebrati attivamente trascritti sono “marcati” da “isole CpG” al 5’. In
queste regioni la frequenza di CpG è uguale a quella attesa nel DNA totale (40% GC),
nella restante parte del genoma è invece più bassa del 20% rispetto all’atteso
•Nel genoma umano il 56% dei geni sono associati a isole CpG: tutti i geni housekeeping
ed il 40% dei geni con espressione tessuto-specifica
•I geni tessuto-specifici sono metilati in CpG nei tessuti dove non sono espressi
Repressori e attivatori possono dirigere
la deacetilazione/acetilazione degli istoni
a livello di specifici geni
Importanza della struttura modulare
e delle interazioni proteina-proteina
Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli
Istoni
I residui amminoacidici all’N-terminale di ciascun istone (20-60 residui)
si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma.
Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere
reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e
metilazione.
Modificazioni degli istoni H3 e H4
La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata.
L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente
attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello
del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato
richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi
acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG
binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la
condensazione della cromatina.
CARATTERISTICHE DELLA
CROMATINA
Caratte ristic a
Cromatina
attiva
Trascrizione attiva
Cromatina
inatti va
Trascrizione inattiva
Conformazione
della cromatina
Estesa, aperta
Condensata
Metilazio ne del
DNA
Poco metilata
specialmente
nelle regioni
del promotore
Istoni acetilati
Metilata
Acetilazione
degli istoni
Istoni non
acetilati
Controllo Trascrizionale
Il metodo principale col quale avviene il
controllo dell’espressione genica negli
eucarioti è una trascrizione selettiva, che
si ottiene grazie a specifiche “DNA
binding proteins”.
Diversamente dai procarioti, la
trascrizione dei geni eucarioti
e’ controllata da numerosi
elementi
TATA
~ -200
ENHANCER
(~ 1-10 kb)
Perche’?
~ -50
PROSSIMALE
PROMOTORE
LA CROMATINA
CORE
TBP
TFIIs
Pol.II
• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al
promotore prima che possa farlo la RNA
polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà
iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame
di proteine regolatorie, attivatori e repressori.
Elementi distali
Elementi
prossimali
Promotore
basale
Il promotore del gene umano dell’insulina
Nero: fattori ubiquitari
Rossi: fattori specifici delle cellule beta pancreatiche
Il complesso trascrizionale dell’RNA polimerasi II viene assemblato a tappe
successive (in vitro)
TBP + TAFs=TFIID
Lodish
Esempio di come i diversi elementi di
controllo di un gene possono integrarsi a
livello del promoter “core”
Classi di fattori trascrizionali
• Zinc finger ( motivo a “dita di zinco”)
• Leucine zipper (serratura a leucina)
• homodomain (omodomini) assomigliano strutturalmente a
regolatori batterici di tipo helix-turn-helix
• Helix-loop-helix (elica-ansa-elica). Le proteine appartenenti a
questa classe, anche nota come HLH possono formare omo o eterodimeri
• Recettori steroidei
Consensus response element (RE)
Response to:
Protein factor which recognizes RE
(T/G)(T/A)CGTCA
cAMP
CREB (also called ATF)
CC(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)(A/T)GG
Serum growth factor
Serum response factor
TTNCNNNAAA
Interferon-gamma
Stat-1
TGCGCCCGCC
Heavy metals
Mep-1
TGAGTCAG
Phorbol esters
AP1
CTNGAATNTTCTAGA
Heat shock
HSP70, etc.
Metodi per studiare i fattori
trascrizionali
•
•
•
•
EMSA
DNA footprinting
Trasfezioni transienti
Geni reporter
Gel Mobility Shift Assay (Electrophoresis Mobility Shift Assay, EMSA)
DNA Footprinting
Saggio per la Beta-galattosidasi
CAT
Luciferasi
LUCIFERINA
OH
S
OXY-LUCIFERINA
N
O-
COOH
-O
S
N
N
S
Luciferasi
N
+ ATP + O2
S
Mg2+
+ AMP +PPi + CO2 + LUCE