Ematologia Pesaro

LA RACCOLTA DELLE CELLULE
STAMINALI EMOPOIETICHE
Stem cell
“Stem cell have received a large amount of attention
recently, both in the scientific and the lay press.” Ematologia Pesaro
“Long before the worldwide obsession with all type of
stem cell started, the stem cells was fully accepted in
the field of hematology”.
Maximov in a scientific presentation in Berlin in 1909
………..“gemeinsame Stamzellen” ……..
Ematologia Pesaro
La cellula staminale emopoietica:
- capacità di autorinnovamento ***
- capacità di differenziarsi in progenitori commissionati°°°
°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°°
*************************
Ematologia Pesaro
FREQUENZA DELLE CELLULE
STAMINALI CD34
• MIDOLLO OSSEO:
CONDIZIONI BASALI
STIMOLATO
1%
5%
• SANGUE PERIFERICO
CONDIZIONI BASALI
STIMOLATO
0.1%
1%
Sorgente di cellule staminali
per Trapianto di Midollo Osseo
Allogenico
Ematologia, Pesaro
RACCOLTA CELLULE STAMINALI
MIDOLLO
ASPIRAZIONI MULTIPLE DALLA CRESTA ILIACA
POSTERIORE IN ANESTESIA GENERALE/SPINALE.
(cresta iliaca anteriore e sterno)
IL MIDOLLO VIENE ASPIRATO, PROCESSATO E
QUINDI CRIOPRESERVATO
O SUBITO REINFUSO
RACCOLTA DI CELLULE STAMINALI DA MIDOLLO OSSEO
Da più di 40 anni è noto che i precursori emopoietici
circolano nel sangue periferico e che possono essere
utilizzati a scopo trapiantologico (Goodman et al, 1962)
Allo steady-state le CD34+ rappresentano circa lo 0,1% di
tutte le cellule nucleate nel S.P.
La semplice somministrazione di chemioterapia
aumenta di molte volte la quota di PBSC circolanti e
questo avviene dopo 10-16 giorni dal trattamento
(Tarella et al, 1991; Richman et al, 1977)
Ematologia Pesaro
Nel 1988 Duhrsen et al. osservarono che il G-CSF
era in grado di aumentare considerevolmente il numero
dei progenitori circolanti…….
…..…e che era possibile raccogliere
un numero sufficiente di queste cellule
con procedure di leucoaferesi
La somministrazione di G-CSF per 3-4 giorni determina
un incremento significativo delle CD34 circolanti da 3,8 x
109/l a 61,9 x 109/l pari ad un incremento di 16,3 volte del
loro basale………….
(Korbling et al, 1995)
Ematologia Pesaro
L’uso combinato di chemioterapia seguita da G-CSF
aumenta ulteriormente la mobilizzazione ed è divenuto il
metodo di più vasto impiego.
(To et al, 1990; Gianni et al, 1989; Brugger et al, 1992)
“ a variety of chemotherapy drugs have been used for
mobilization”
(Gillespie et al, 1996)
Ematologia Pesaro
RACCOLTA CELLULE STAMINALI
SANGUE PERIFERICO
• La raccolta di cellule staminali da sangue periferico
avviene tramite passaggio del sangue in una
macchina che e’ in grado di identificare le cellule
staminali e di trattenerle, restituendo tutte le altre
cellule al paziente.
• Le cellule staminali cosi’ raccolte vengono
concentrate e criopreservate o subito reinfuse.
RACCOLTA DI CELLULE STAMINALI DA SANGUE PERIFERICO
Fattori che influiscono sulla raccolta delle PBSC:
1) Complessità biologica del CFU-GM assay, dipidendente da variabili:
Presenti in vivo: - età
- tipo di patologia
- interessamento midollo osseo
- precedenti chemioterapia (fludarabina, melfalan, ecc)
Presenti in vitro: - tensione di ossigeno
- fattori di crescita delle colonie:
(siero fetale,fitoemoagglutinina)
GM-CSF, G-CSF, IL3, IL6, stem cell factor e loro associazioni)
- presenza di T linfociti e monociti
2) Diversità metodi di criopreservazione
3) Diversità criteri di valutazione
4) Mancanza di standardizzazione
Ematologia Pesaro
Criopreservazione delle cellule staminali
emopoietiche (CSE)
•CSE vitali per 2-3 giorni a temperature > a t. di congelamento
•La criopreservazione mantiene inalterate le caratteristiche
biologiche oltre i limiti di tempo naturali.
•Si esegue con congelatore programmato in azoto liquido
•Possibili danni della crioconservazione:
1. Cristalli di ghiaccio e danno degli organuli cellulari
2. Cristalli di ghiaccio extracellulari e disidratazione delle cellule
3. Reidratazione ed espansione delle cellule durante
lo scongelamento
4. Funzionamento parziale degli enzimi cellulari a basse
temperature con possibile accumulo di metaboliti tossici
intermedi
Criopreservazione delle cellule staminali
emopoietiche (CSE)
Crioconservante:
dimetilsulfossido (DMSO) al 5-10%
(disidratazione parziale intracellulare)
Principi base:
•DMSO aggiunto al plasma pochi ml alla volta mentre viene
raffreddato su ghiaccio (reazione esotermica) → midollo
•Viene mantenuto lo stesso profilo termico delle componenti
della miscela
•Controllo della velocità di raffreddamento
Crioconservazione e scongelamento
•A lungo termine a -196 °C, a -80°C per brevi periodi
•Tempo 3-5 anni (max 10 anni ma con controllo della
vitalità)
•Scongelamento delle sacche a bagno maria (37-38°C)
nel più breve tempo possibile
•Reinfusione subito dopo lo scongelamento
STEM CELL TRANSPLANTATION
Which non-malignant diseases ?
ALLO-SCT
AUTO-SCT
Aplastic Anemia
+
-
Fanconi Anemia
+
-
Hemoglobinopathies
+
-
PNH
+
-
SCI
+
-
Wiskott-Aldrich syndrome
+
-
Hereditary storage diseases
+
-
+
-
+
-
Congenital leucocyte disfunctions
Glanzmann and thromboastenia
Ematologia Pesaro
STEM CELL TRANSPLANTATION:
Which malignant diseases ?
ALLO-SCT
AUTO-SCT
AML
+
+
CML
+
-
IMF
+
+
MDS
+
+
HD/NHL
+
+
MM
+
+
HCL
+/-
+/-
Infant blastomas
+/-
+/-
Renal carcinoma
+/-
+/-
Breast cancer
+/-
+/-
Other cancers
+/-
+/Ematologia Pesaro
GITMO Allogeneic Transplants 2004
726
490
258
1430
277
66
6
835
2714
661
1957
106
Leucemia Mieloide Acuta
Leucemia Linfatica Cronica
MielMult/Plasmacell
Tumori Solidi
Anemia Aplastica
Talassemia
Malattie Autoimmuni
2281
Leucemia Linfatica Acuta
Leucemia Mieloide Cronica
Linfomi
MDS/MPS
Immunodeficienze
Errori genetici
LEUCEMIE ACUTE
Ematologia Pesaro
Use of peripheral blood stem cells for autologous
transplantation in acute myeloid leukemia patients
allows faster engrafment and equivalent disease-free
survival compared with bone marrow cells.
Visani G. et al
Bone Marrow Transplant, 1999
91 AML patients: antracycline-based induction
high-dose cytarabine consolidation
from Jan 1993 to Jun 1996
Use of peripheral blood stem cells for autologous
transplantation in acute myeloid leukemia patients
allows faster engrafment and equivalent disease-free
survival compared with bone marrow cells.
Visani G. et al
Bone Marrow Transplant, 1999
88 AML evaluable patients:
73 CR
16 ALLO BMT
15 Resistant
44 AUTO
21 AMBT
23 PBSC (NOVIA+G-CSF)
*neutrophil and plateled recovery shorter in PBSC
* toxicity and relapse was similar
Fludarabine-containing regimens severely
impair
peripheral blood stem cells mobilization and collection
in acute myeloid leukemia patients.
Visani G. et al
Br J Haematol, 1999
31 AML pt
induction/consolidation treatment containing
fludarabine (ICE-FLAN-FLAN)
RC= 68% after ICE
and 84% after ICE-FLAN
Fludarabine-containing
regimens
severely
impair
peripheral blood stem cells mobilization and collection in
acute myeloid leukemia patients.
Visani G. et al
Br J Haematol, 1999
To mobilize PBSC 19 pz FLAN+ G-CSF (from day 13 at 10mg/Kg)
13 pt (69%) nonmobilizer
Second mobilization with G-CSF:
not achieved in 8/10 pt
insufficient in 2/10 pt (<1x106 CD34+/Kg)
Fludarabine-containing
regimens
severely
impair
peripheral blood stem cells mobilization and collection in
acute myeloid leukemia patients.
Visani G. et al
Br J Haematol, 1999
harvest adequate in 92%
(mean of 8,8x108/Kg nucleated cells)
and ABMT performed in 10/12 pt
“Esperienza di Pesaro”
Mini-ICE effectively mobilises peripheral blood stem cells
after fludarabine-based regimens in acute myeloid
leukemia
Mele A*, Leopardi G*, Sparaventi G*, Nicolini G*, D’Adamo
F*, Guiducci B*, Barulli S*, Malerba L*, Stramigioli S*, Talevi
N*, Politi P°, Isidori A”, Malagola M”, Piccaluga P”, Visani G*.
Department of Haematology, Hospital San Salvatore Pesaro*
Trasfusional
Centre-Hospital
San
Salvatore-Pesaro°,
Institute of Haematology and Medical Oncology, “Seragnoli”,
University of Bologna”
Eur J Haematol, 2005
Ematologia Pesaro
Mini-ICE effectively mobilises peripheral blood stem cells
after fludarabine-based regimens in acute myeloid
leukemia.
mobilization and collection of PBSC of a low dose regimen:
5-days-Mini-ICE administered after fludarabine based
regimens in seven adult AML patients.
- oral idarubicin 20 mg/mq
on day 1, 3 and 5
- etoposide 100 mg/mq
twice a day, days 1-3
- ARA-C 50 mg/mq s.c.
twice a day for 5 days)
Ematologia Pesaro
Characteristics of patients submitted to Mini-ICE therapy
Case
Sex
Age
(y)
FAB
Karyotype
1
2
3
4
5
6
7
F
M
F
F
F
F
M
29
34
56
63
33
33
40
M4 47XX+ 22; inv16
M0
+4
M4
normal
M0
n. v.
M1
n. v.
M4 Inv.16, t(15;21)
M0
47 XY+8
diagnosis
de novo
de novo
de novo
post MDS
de novo
de novo
de novo
Ematologia Pesaro
DCE (7)
PR (1)
NR (6)
DCE II
FLAG I
CR (6)
FLAG II
CR (7)
Mini-ICE + G-CSF(7)
Harvest
Abbreviation: DCE, daunorubicin, cytarabine, etoposide; PR, partial remission; NR, not
responders; FLAG, fludarabine, cytarabine; CR, complete remission; Mini-ICE, idarubicine,
cytarabine, etoposide; G-CSF, granulocyte colony stimulating factor.
Ematologia Pesaro
Table I. Characteristics of patients submitted to Mini-ICE therapy
Case
Sex
Age
(y)
FAB
Karyotype
1
2
3
4
5
6
7
F
M
F
F
F
F
M
29
34
56
63
33
33
40
M4 47XX+ 22; inv16
M0
+4
M4
normal
M0
n. v.
M1
n. v.
M4 Inv.16, t(15;21)
M0
47 XY+8
diagnosis
de novo
de novo
de novo
post MDS
de novo
de novo
de novo
apheresis
(n)
1
1
1
2
2
2
2
CD34+ cells
(x 106/Kg)
collected
10.9
10.1
15.2
3.08
3.1
4,49
8,1
Ematologia Pesaro
Median number of harvested CD34+ cells was
8.1x106/Kg (range 3.08-15.2).
All the patients were successfully submitted to PBSC
transplantation.
We suggest that the Mini-ICE program is feasible, well
tolerated and effective in terms of PBSC mobilization and
collection in “low yield” AML patients previously treated with
fludarabine.
Ematologia Pesaro
Whatever mobilizing and/or releasing regimen is used, in a
small proportion of patients a sufficient dose of PBSC
cannot be collected (poor mobilizer)……
Ematologia Pesaro
Pegfilgrastim effectively mobilizes PBSC in a poor
mobilizer multiple myeloma patient: a case report
Lara Malerba, Anna Mele, Giuliana Leopardi, Stefania
Stramigioli, * Patrizia Politi, Giuseppe Visani
Department of Haematology- Hospital San SalvatorePesaro, Italy, * Trasfusional Centre-Hospital San
Salvatore-Pesaro, Italy
Haematologica, in press
Ematologia Pesaro
December 2003, a 65-year-old man III A IgG/k multiple myeloma.
-3 couses of polichemotherapy (DC-IE):SD.
- cyclophosphamide (7g/sqm) plus daily 10 g/kg G-CSF in order to
mobilize PBSC, without success.
After two months off therapy, the disease progressed and the
patient received alternate cycles VAD/high dose dexamethasone.
A second attempt to mobilize PBSC, using daily 10 g/kg G-CSF
after the second and third VAD cycle, failed.
Single dose of 12 mg pegfilgrastim
on day 5 after a fourth VAD course.
On day + 10 post chemotherapy the CD34+ cell count was
24/microlitre and two apheresis were performed, harvesting 1,6x106
and 0,89x106 CD34+ cell/kg, respectively;(total 2,49x106 cells/kg).
The only side effect was moderate skeletal pain.
The patient underwent successful transplantation.
Ematologia Pesaro
…..passaggio dal midollo al sangue periferico
come fonte
di cellule
staminali
SOURCE
OF STEM
CELLS
100
% TRAPIANTI
90
80
BM
70
PBSC
60
BM+PBSC
50
CB
40
30
20
10
0
<1992
1992-1995
1996-1999
ANNI
2000-2003
A FAVORE PBSC
-precocità e stabilità dell’attecchimento
-equivalenza, se non addirittura riduzione, della incidenza
e della gravità della GVHD acuta (Korbling et al, 2001;
Besinger et al, 2001)
-recupero immunologico più veloce
-riduzione dei tempi di ospedalizzazione
- ………..no anestesia generale e/o spinale
Ematologia Pesaro
CONTRO
-incremento GVHD cronica (Brown et al, 1999)
-…………”impegno prolungato” 5-7 giorni stimolazione, 2-3
leucaferesi, effetti collaterali, accesso venoso etc..
Ematologia Pesaro
PROTOCOLLO
PILOTA
ESPLORATIVO
DI
APPLICAZIONE E DI STUDIO DEL TRAPIANTO APLOIDENTICO DI CELLULE STAMINALI IN PAZIENTI
AFFETTI DA EMOPATIE MALIGNE AD ALTO
RISCHIO E/O RESISTENTI CHE NON DISPONGONO
DI DONATORE FAMILIARE HLA IDENTICO O MISSMATCH UNRELATED (MUD).
Ematologia
Ematologia Pesaro
Pesaro
L’esperienza di Pesaro
Solo in casi selezionati vengono utilizzate PBSC
(TMO aplo-identico; TMO con malattia in almeno II RC)
Preferenza delle cellule staminali da Midollo Osseo!!
Ematologia, Pesaro
Probabilità di avere un donatore HLA identico…
25% familiare HLA identico
50-60% matched unrelated donor (MUD)
…spesso però il tempo della ricerca è inconciliabile
con l’urgenza clinica delle emopatie acute…….
Ematologia Pesaro
Per contro sono quasi sempre
disponibili familiari
(genitori, figli, fratelli)
incompatibili per due-tre loci
che possono essere
immediatamente disponibili
come donatori !!
Ematologia Pesaro
Concetto della Megadose
MEGADOSE CD34+ (CD34+ > 106 cellule/Kg)
in grado di consentire l’attecchimento
con ricostituzione ematopoietica full-donor
…rigetto mediato dai precursori dei
linfociti T Citotossici del ricevente
(CTL-P)
Ematologia Pesaro
TRAPIANTO APLO-IDENTICO
2005……Pesaro
Concetto della Megadose (a+b)
a) PBSC con selezione in positivo
CD34+ mediante CliniMACS
b) midollo con selezione in negativo
(T deplezione) mantenendo quota linfociti T
CD3+ nell’inoculo (1,8x105/Kg)
effetto GVL
Ematologia Pesaro
Ragazza di 12 anni
LAM M1 (trisomia del 4) diagnosticata nel giugno
2002 in seguito ad esami ematochimici eseguiti per
“pallore” ed astenia Hb=4,2 gr/dl Bl=20% nel SP e
80% nel MO
TERAPIE ESEGUITE c/o altro Centro:
21-27/6/2002: ICE secondo AIEOP LAM 2002
8/2002 FLANG+Daunoxome
9/2002 MEC
NR
NR
Persistenza di malattia
Ematologia Pesaro
Giunge alla nostra attenzione nel ott. 2002 con:
GB=400
Hb=8,2
PLT=29000
Figlia unica, no donatori da banca…………………
HLA-A
HLA-B
HLA-C
Madre
01, 68
44, 53
04, 16
Figlia
01, 68
53, 57
04, 16
Ematologia Pesaro
TRAPIANTO :
Condizionamento: BU 16, Thiotepa 10, Endoxan 160,
ATG 15mg/Kg.
Profilassi GVHD: CSA, sMTX
DON/RIC 0 NEG/B NEG
REINFUSIONE CELLULE STAMINALI
il 28-11-2002 con selezione in positivo CD34+
GVHD acuta +13 (metilprednisolone 2 mg/Kg)
Mucosite grado II
Ematologia Pesaro
Il g+21: DNA 100% Donor, RC ematologica,
assenza trisomia 4
Ha sospeso la terapia immunosoppressiva il 27-9-03
Ultima valutazione (+ 6 anni) nel 11-2008:
R.C., stabile attecchimento allogenico (100% donor),
assenza trisomia del 4.
nessuna terapia
Ematologia Pesaro