Lezione 8 2010-11

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO AA 2010-11
Adriana Maggi
LEZIONE 8
Ingegneria cellulare
Ingegneria Cellulare
Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante
mutazioni del genoma stesso o
integrazione di DNA esogeno
Finalità dell’ingegneria cellulare applicate
alla farmacologia
• Identificazione di bersagli di farmaci
• Screening di farmaci
• Produzione di proteine terapeutiche
• Terapia cellulare
Ingegneria cellulare
considerazioni preliminari
1. Gene/processo di interesse
2. Tipo di cellula da transfettare
3. Scelta del vettore
4. Modalità di transfezione/infezione
5. Applicazioni
La scelta del sistema cellulare 1.
• coltura primaria
• cellula immortalizzata
• linea tumorale
Scelta del sistema cellulare 2.
1. Facilità di coltura e stabilità
2. Efficienza di transfezione
3. Modificazioni post-traduzionali
4. Espressione di fattori di regolazione
dell’espressione genica
5. Facilità di analisi immunologica o di
purificazione della proteina (espressione di
proteine omologhe)
Scelta del vettore per ingegneria cellulare
1. La scelta del vettore
Determinata dal tipo di sistema che si vuole
generare:
1. iperespressione proteica
2. espressione regolata per studio della
funzione del gene, per produzione limitata
nel tempo
3. studio della regolazione della espressione
di un gene
Vettori per ingegneria cellulare
 sequenze per la replicazione in procariote
 Cassetta di espressione

Polylinker

Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.)

Modificazioni posttrascrizionali (Siti
di:
terminazione della trascrizione; poliadenilazione; segnali di
splicing

)
Marcatori di selezione
Vettori di espressione: il vettore pCI-neo
E.Coli ori
Promotore virale
Amp resistenza
Introne chimerico
Polylinker
Poliadenilazione
Neo resistenza
Promotore
T7 pol
Promotore
T3 pol
Poliadenilazione
Origine di replicazione del
fago f1
Promotore virale
T-antigen e cellule COS.
L’uso di cellule COS consente di
ottenere alti livelli di espressione di
proteine esogene senza l’utilizzo di
promotori virali forti. Il gene è
clonato in un plasmide che include
l’origine di replicazione virale di SV40.
Le cellule Cos contengono, nel loro
genoma, il gene codificante per il Tantigen, una proteina che riconosce
l’origine di replicazione di SV40 e
stimola una massiccia replicazione del
plasmide.
Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off
Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale
dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza
di E. Coli è possibile regolare l’espressione di un
transgene.
Il sistema è composto da un transattivatore
chimerico che lega tet-responsive-element TRE
espresso in modo costitutivo (promotore virale o
tessuto-specifico)
Il gene la cui trascrizione deve venire regolata è
sotto il controllo di un promotore contenente TRE
Il sistema Tet-on/Tet-off
E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore di
regolazione ed un plasmide contenente il transgene sotto il controllo
trascrizionale di un promotore responsivo alla tetraciclina.
pCMV
tetR
VP16
Tet-OFF
pCMV
rtetR
VP16
Tet-ON
Transcription
TRE
Pmin CV
Gene of interest
Plasmidi
codificanti per
l’elemento di
regolazione
Plasmide
contenente il
transgene
Il sistema Tet-off
basato sulla produzione della proteina transattivante tTA
è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina
Il sistema Tet-On
basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA
è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina
Integrazione di DNA esogeno nel
genoma cellulare
Gene trapping ( integrazione casuale)
Gene targeting (integrazione sito-specifica)
La ricombinazione omologa è il processo alla base della
integrazione sito specifica
Es. di gene targeting
GENE knock-out; GENE Knock-in
DNA target
Integrazione sito
specifica
Gene targeting vector
Integrazione random
C9H13N5O4 peso molecolare: 255.23
Ganciclovir, un analogo di nucleosidi che puo’ essere fosforilato ad un
tripfosfato analogo da parte dell’enzima timidina cinasi di Herpes
simplex e quindi integrato nel DNA.
Timidino chinasi
Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio”
L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio
Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT
(Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile
5-fosforibosil-1pirofosfato
Uridina monofostato
AMINOPTERINA
Timidina monofostato
Inosina
monofostato
Guanina
monofostato
Ipoxantina
Adenina
monofostato
Timidina
3. Modalità di trasfezione
Transfezione transiente o stabile
Tecnologia per la transfezione
Transfezioni stabili o transienti
Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e
viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel
genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo
pochi cicli replicativi
Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel
genoma della cellula ed in presenza di una adeguata
pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi
in coltura.
La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine
di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate
Transfezione stabile
Durante le prime 48 ore dopo la
transfezione, fino al 50% delle cellule
contengono il DNA esogeno. In seguito,
a causa della degradazione e della
diluizione, le cellule che non hanno
integrato tale DNA nel loro genoma lo
perdono. Per isolare le cellule
transfettate stabilmente occorre
applicare una pressione selettiva,
utilizzando un apposito marker di
selezione.
Marcatori di selezione per cellule di mammifero
ENZIMA
FARMACO
MECCANISMO
Aminoglicoside
fosfotransferasi (APH)
G418 (Inibitore sintesi
proteica)
APH inattiva G418
Diidrofolato reduttasi
(DHFR)
Metotrexate (Inibisce
DHFR)
Variante resistente DHFR
Igromicina
fosfotransferasi (HPH)
Igromicina B (Inibitore
sintesi proteica)
HPH inattiva igromicina
Adenosina deaminasi
(ADA)
9-b-D-furanosil
(XylA)
(danneggia DNA)
Inattiva Xyl-A
Xantina-guanina
fosforibosil transferasi
(XGPRT)
Acido micofenolico
(Inibisce sintesi GMP)
XGPRT sintetizza GMP
Timidina chinasi (Tk)
Aminopterina (Inibisce
sintesi timidina-P)
Tk fosforila la timidina
Transfezione stabile - applicazioni
Generazione di linee cellulari con caratteristiche
specifiche per la produzione di biofarmaci o lo
screening di molecole farmacologicamente attive.
Servono markers specifici per poter selezionare le
cellule transfettate
Transfezione transiente - applicazione
Studio della regolazione dell’espressione genica con
sistemi reporter
Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale
Identificazione di molecole attive su enzimi o
recettori
Studi di correlazione struttura attività di mutanti