PCR real time nel monitoraggio dell`infezione da BKV - E
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PCR real time nel monitoraggio dell`infezione da BKV - E
PCR real time nel monitoraggio dell’infezione da BKV V.Salotti e A.Azzi BK virus nelle urine dopo ultracentrifugazione La scoperta di BKV Gardner SD, Field AM, Coleman DV, Hulme B. New human papovavirus (B.K.) isolated from urine after renal transplantation. Lancet 1971 Infezione da BKV • Infezione primaria Prima infanzia Via respiratoria Rene trapiantato • Latenza rene linfociti cervello • Riattivazione ….. Tratto urinario viruria Infezione da BKV: eziopatologia • Soggetti immunocompetenti • Trapiantati di midollo • Trapiantati renali • AIDS • asintomatica • Cistite emorragica • Stenosi ureterale •Interstitial nephropathy (PVAN) • Meningite, infezione disseminata ….. •Tumori ? Ricerca del DNA virale PCR qualitativa Nelle urine • • • • • Soggetti sani gravidanza Trapiantati di midollo AIDS Trapiantati rene 17 % 15 % 77 % 40 % [25 %] Nei linfociti • Soggetti sani • Trapiantati di midollo • AIDS 53 % 57.5 % 62.5 % Ricerca del DNA di BKV nel plasma /siero • La presenza di virus libero in circolo nei trapiantati di rene è considerata un indicatore di patologia renale BKV – associata. • Livelli significativi da definire Organizzazione del genoma dei polyomavirus • PCR qualitativa per DNA di BKV PCR quantitativa competitiva per BKV • • • • • L’estrazione dei campioni La sintesi del competitore La calibrazione del competitore La reazione La rivelazione Sintesi del competitore • Mutagenesi sito-specifica/hot start PCR • NcoII: 5’TATTTTGCCATGGAGATATG 3’ • NcoI: 5’CATATCTCCATGGCAAAATA 3’ • • • • Enzima NcoI ccatgg ggtacc PEP 1 Nco II target T A sequence Nco I PEP 2 Mutagenesis obtained with the primer Nco II G C G C Mutagenesis obtained with the primer Nco I Denaturation and Rinaturation 5’ 3’ 5’ 3’ Extension with the primers PEP 5’ 5’ standard Fig.. 1 PCR site-directed mutagenesis. • Mix + Taq gold • 5 l estratto campione urina • 40 fg – 200 fg – 1 pg – 5 pg – 25 pg competitore PCR quantitativa competitiva per DNA di BKV: la rivelazione Quantificazione dei prodotti della PCR • Software Molecular Analyst (Bio-Rad) • y • . Y= OD banda comp x 1.88 • • • • • • . . OD banda campione . x log[conc competitore] calcolo retta di regressione e coefficiente di regressione lineare Trapiantati di midollo Cistite emorragica Carica virale nelle urine PCR quantitativa competitiva PCR quantitativa competitiva per BKV • Limiti – – – – – Tempi Costi Manualità Sensibilità riproducibilità