PCR real time nel monitoraggio dell`infezione da BKV - E

PCR real time nel monitoraggio
dell’infezione da BKV
V.Salotti e A.Azzi
BK virus nelle urine
dopo ultracentrifugazione
La scoperta di BKV
Gardner SD, Field AM, Coleman DV,
Hulme B.
New human papovavirus (B.K.) isolated
from urine after renal
transplantation.
Lancet 1971
Infezione da BKV
• Infezione primaria
Prima infanzia
Via respiratoria
Rene trapiantato
• Latenza
rene
linfociti
cervello
• Riattivazione
…..
Tratto urinario
viruria
Infezione da BKV: eziopatologia
• Soggetti
immunocompetenti
• Trapiantati di midollo
• Trapiantati renali
• AIDS
• asintomatica
• Cistite emorragica
• Stenosi ureterale
•Interstitial nephropathy (PVAN)
• Meningite, infezione
disseminata …..
•Tumori ?
Ricerca del DNA virale
PCR
qualitativa
Nelle urine
•
•
•
•
•
Soggetti sani
gravidanza
Trapiantati di midollo
AIDS
Trapiantati rene
17 %
15 %
77 %
40 %
[25 %]
Nei linfociti
• Soggetti sani
• Trapiantati di midollo
• AIDS
53 %
57.5 %
62.5 %
Ricerca del DNA di BKV nel
plasma /siero
• La presenza di virus libero in circolo nei
trapiantati di rene è considerata un
indicatore di patologia renale BKV –
associata.
• Livelli significativi da definire
Organizzazione del genoma dei
polyomavirus
•
PCR qualitativa per DNA
di BKV
PCR quantitativa competitiva
per BKV
•
•
•
•
•
L’estrazione dei campioni
La sintesi del competitore
La calibrazione del competitore
La reazione
La rivelazione
Sintesi del competitore
• Mutagenesi sito-specifica/hot start PCR
• NcoII: 5’TATTTTGCCATGGAGATATG 3’
• NcoI: 5’CATATCTCCATGGCAAAATA 3’
•
•
•
•
Enzima NcoI
ccatgg
ggtacc
PEP 1
Nco II
target
T
A
sequence
Nco I
PEP 2
Mutagenesis obtained with the primer Nco II
G
C
G
C
Mutagenesis obtained with the primer Nco I
Denaturation and Rinaturation
5’
3’
5’
3’
Extension with the primers PEP
5’
5’
standard
Fig.. 1 PCR site-directed mutagenesis.
• Mix + Taq gold
• 5 l estratto campione urina
• 40 fg – 200 fg – 1 pg – 5 pg – 25 pg
competitore
PCR quantitativa competitiva per
DNA di BKV: la rivelazione
Quantificazione dei prodotti della
PCR
• Software Molecular Analyst (Bio-Rad)
•
y
•
.
Y= OD banda comp x 1.88
•
•
•
•
•
•
.
.
OD banda campione
.
x
log[conc competitore]
calcolo retta di regressione e coefficiente di regressione lineare
Trapiantati di midollo
Cistite emorragica
Carica virale nelle urine
PCR quantitativa
competitiva
PCR quantitativa competitiva
per BKV
• Limiti
–
–
–
–
–
Tempi
Costi
Manualità
Sensibilità
riproducibilità