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workshop ERSAF, 28 maggio, 2008
Il ruolo dei microrganismi nella digestione
anaerobica
Prof. Daniele Daffonchio
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM),
Università di Milano
IL METABOLISMO MICROBICO
Il metabolismo si divide in catabolismo ed anabolismo.
I microrganismi possono essere distinti e classificati sulla base del loro
catabolismo e delle esigenze nutrizionali.
•Fonte di energia
Radiazione
Fototrofi
Ossidazione
Chemotrofi
Prod. inorg. ridotti
NH4+; NO2-; S2-; S; S2O32-
Molec. org. ridotte
Zuccheri; lipidi; proteine
•Donatore di H
•Accettore di
e-
O2;
Mol.org.ox; NO3-; SO42-; CO2
Aerobi
Anaerobi
Le molecole entrano nelle cellule attraverso trasporto attivo mediato da
ATPasi associate alle membrane, o attraverso trasporto passivo con un
sistema di traslocazione che coinvolge zuccheri fosforilati
IL METABOLISMO CATABOLICO
Lo schema generale del catabolismo è diviso in tre stadi:
STADIO 1
Degradazione delle molecole complesse in monomeri più piccoli.
Non viene rilasciata energia.
STADIO 2
Ulteriore degradazione dei monomeri con rilascio di parte
dell’energia sottoforma di ATP, potere riducente (es. NADH+) e
importanti intermedi metabolici (es. piruvato):
STADIO 3
Completamento della degradazione dei substrati e raccolta della
maggior quantità di energia (ATP; potere riducente) con il ciclo di
Krebs accoppiato alla catena di trasporto degli elettroni
(respirazioni aerobiche e anaerobiche) od alle fermentazioni.
IL CATABOLISMO OSSIDATIVO
Se si sottraggono
intermedi dal ciclo (ad
es. per le biosintesi
metaboliche, o per la
produzione industriale)
reazioni anaplerotiche
(di riempimento)
intervengono per
ripristinare l’equilibrio
ricostituendo i precursori
del ciclo
Reazioni
anaplerotiche
IL CATABOLISMO FERMENTATIVO
Glucosio
IL METABOLISMO ANABOLICO
dalle vie degradative
principali si originano
tutti i pathways
anabolici: per
aminoacidi alifatici e
aromatici, lipidi,
nucleotidi purinici e
pirimidinici, ecc.
LA METANOGENESI
Acidogenesi
POLIMERI
1
MONOMERI
1
Acetogenesi
ALCOLI SUCCINATO
LATTATO
ACIDI GRASSI C2 C3
COMP. C1
H2
ACETATO
3
4
5
CH4 CO2
2. Batteri fermentanti secondari
(sintrofici)
3. Batteri omoacetogeni
4. Metanogeni idrogenotrofi
5. Metanogeni acetoclasti
Metanazione
2
1. Batteri fermentanti acidogeni
primari
GLI ARCHAEA METANOGENI
ORDINE: METHANOBACTERIALES
Famiglia: Methanobacteriaceae
Genere:Methanobacterium
Genere: Methanobrevibacter
H2/CO2
Genere: Methanosphaera
formiato
Famiglia: Methanothermaceae
Genere: Methanothermus
ORDINE: METHANOCOCCALES
Famiglia: Methanococcaceae
Genere: Methanococcus
H2/CO2
ORDINE: METHANOMICROBIALES
Famiglia: Methanomicrobiaceae
Genere: Methanomicrobium
Genere: Methanogenium
H2/CO2
Genere: Methanoculleus
Genere: Methanospirillum
Famiglia: Methanocorpusculaceae
Genere: Methanocorpusculum H2/CO2
Famiglia: Methanoplanaceae
Genere: Methanoplanus
H2/CO2
Famiglia: Methanosarcinaceae
Genere: Methanosarcina
acetato H2/CO2
Genere: Methanococcoides
Genere: Methanolobus
methanolo
Genere: Methanohalophilus
Genere: Methanosaeta/Methanotrix acetato
LE REAZIONI DI METANAZIONE
4H2 + HCO3- + H+
CH4 + 3H2O
4HCOO- + H+ + H2O
CH4 + 3 HCO3-
CH3COO- + H2O
CH4 + HCO3-
ACETATO: AFFINITA’ E Vmax
Ks
Vmax
(mM)
(h-1)
Methanosarcina
0.7
0.032
Methanosaeta
5
0.002-0.003
GENOMI SEQUENZIATI
METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA
E’ un processo metabolico molto meno esoergonico della respirazione
aerobica o delle respirazioni anaerobiche
La conversione di un esoso a CH4 rilascia solo il 15% dell’energia ottenibile
dalla degradazione aerobica
C6H12O6 + 6O2
C6H12O6
6CO2 + 6H2O (DG°’ = -2870 kJ/mole)
3CO2 + 3CH4 (DG°’ = -390 kJ/mole)
La bassa resa energetica della metanogenesi costringe i microrganismi
coinvolti a cooperare molto efficientemente ed a stabilire relazione di
“SINTROFIA”
la cooperazione tra 2 organismi che dipendono l’uno dall’altro. La mutua
dipendenza non può essere sostituita dall’aggiunta di nutrienti. Ad es. la cocoltura di Methanobacillus omelianskii degrada l’etanolo a:
Strain S
2CH3CH2OH + 2H2O
2CH3COO- + 2H+ + 4H2 (DG°’ = +19 kJ per 2 mol of ethanol)
Strain M.o.H.
4H2 + CO2
CH4 + 2H2O (DG°’ = -131 kJ per mol of methane)
Co-Culture
2CH3CH2OH + CO2
2CH3COO- + 2H+ + CH4 (DG°’ = -112 kJ per mol of methane)
METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA
Un processo che favorisce la sintrofia è il
TRASFERIMENTO INTERSPECIE DI H2, HCOO- E CH3COOin cui un efficiente “scavenger” per questi substrati (es. metanogeni o
solfatoriduttori) ne mantiene una bassa concentrazione, favorendone la
produzione da parte degli acetogeni sintrofici
METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA
METANOGENESI: PATHWAYS ALTERNATIVI
1
COMP. C1
H2
ACETATO
2
3
CH4
CO2
Metanazione
MONOMERI (glucosio)
Acetogenesi
Oltre al classico network metabolico con 3 livelli trofici (acidogenesi, acetogenesi,
metanazione) è stato identificato un network metabolico a 2 livelli (acetogenesi e
metanazione), in cui un gruppo batterico, le spirochete, produce direttamente acetato,
H2 e CO2 da glucosio insieme a quantità variabili di lattato ed etanolo.
1 Spirochete; 2 Metanogeni H-trofi; 3 Metanogeni acetoclasti
In presenza di efficienti “scavenger” per l’H2 come i metanogeni la maggior parte del
flusso elettronico del metabolismo delle spirochete va nella direzione di acetato, H2 e
CO2 a spese di lattato ed etanolo. In questa situazione metabolica gli acetogeni sintrofici
hanno un ruolo insignificante ed il processo di metanogenesi viene completato in due
livelli trofici.
COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE
Quale è la stabilità dei processi metabolici metanogenici esposti a stress?
La risposta di reattori con i 2 tipi di pathway metanogenici (a 2 o 3 livelli) a shock da sovraccarico di
substrato indica che la miglior reazione metabolica si ha dove il flusso elettronico di degradazione
del substrato a CH4 avviene per vie metaboliche parallele piuttosto che sequenziali.
FLUSSI METABOLICI PARALLELI
Nel caso di reattori ad alto contenuto di spirochete la formazione dei substrati di metanazione
(acetato ed H2) da glucosio avviene attraverso 2 vie indipendenti, quella diretta catalizzata dalle
spirochete a quella con l’intervento di acetogeni sintrofici
FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI
Nel pathway metanogenico a tre livelli la produzione di acetato e H2 avviene attraverso step
metabolici sequenziali catalizzati da diversi gruppi trofici.
COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE
Per verificare la risposta a stress di sovraccarico organico di comunità microbiche
metanogeniche che si differenziano per flussi metabolici paralleli piuttosto che
sequenziali, sono stati comparati due tipi di reattori derivanti dal medesimo inoculo e
condotti nelle medesime condizioni operative, ma selezionati sulla base di differenze per
il tempo medio di residenza cellulare (17,5 contro 5,8 giorni) .
FLUSSI METABOLICI PARALLELI
FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALI
COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE
L’analisi d’immagine
computerizzata
dei
morfotipi microbici e
l’analisi ARDRA dei
cloni in librerie di 16S
ottenute dai due set di
reattori
indicavano
una distinta composizione in m.o.:
REATTORI HS (highspirochete) dominati
da
spirocheTe,
bastoncini
corti
e
Methanosarcina.
REATTORI LS (low
spirochete) dominati
da cocchi e Methanosaeta. Il sovraccarico di substrato (glucosio) determinava una
maggior variazione delle popolazioni nelle comunità HS che ritornavano alla
composizione iniziale dopo 24 giorni dall’inizio della perturbazione. Mentre le
popolazioni nel reattore LS rimanevano relativamente stabili.
COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE
Dal punto di vista metabolico, la comunità LS reagiva più prontamente:
ripristinando in un tempo più breve gli
equilibri iniziali di concentrazione dei
metaboliti
del
processo
di
metanogenesi.
Le caratteristiche del processo HS
erano:
i) Più lenta utilizzazione del substrato
glucosio.
ii) Mantenimento di un livello più
basso dei metaboliti intermedi.
iii) Inizio simultaneo dei diversi
processi fermentativi (produzione dei
diversi acidi).
METANOGENESI: DIVERSITA’ MICROBICA E STABILITA’
FUNZIONALE
Comunità microbiche con i principali flussi metabolici
paralleli sono funzionalmente più stabili in risposta a
perturbazioni esterne come shock da sovraccarico organico
rispetto a comunità con flussi metabolici seriali.
Comunità microbiche più complesse (con maggiore
biodiversità) possono rispondere meno prontamente agli
stress di comunità microbiche più semplici ma organizzate
in maniera funzionalmente diversa.
Per un’efficiente risposta agli stress alla biodiversità
genetica e fenotipica deve accompagnarsi una biodiversità
funzionale.
METANOGENESI: I REATTORI
Per la digestione
anaerobica dei
reflui si
distinguono diversi
tipi di reattori che
si differenziano
per:
•Schema idraulico
dei sistemi
•Forma della
biomassa (libera,
adesa)
METANOGENESI: I REATTORI PER REFLUI
•Reattori a biomassa libera
•Reattori a biomassa adesa
Migliore contatto tra le cellule e migliore sintrofia
(es. la rimozione dell’H2 prodotto dagli acetogeni sintrofici, Sintrophomonas e Sintrophobacter,
da parte dei metanogeni idrogenotrofi che agiscono da “scavenger” dell’H 2 tossico per gli
acetogeni)
Stabilità della biomassa nel reattore
(basso “washout” cellulare)
Reattori UASB
(upflow anaerobic sludge bed)
Reattori a letto fisso
espanso fluidizzato
Strati di microrganismi
La biomassa è organizzata in
biofilm autoimmobilizzato in
granuli compatti (diam. 0.1-1
cm) ad alta sedimentabilità
Materiale di supporto
Le cellule sono
immobilizzate in un biofilm
adeso ad un supporto inerte
(plastica, legno,ecc.)
METANOGENESI: I REATTORI UASB
Biogas
Ricircolo
Effluente
Influente
MESOFILI
TERMOFILI
METANOGENESI: I REATTORI UASB
Nei reattori UASB (Upflow anaerobic
sludge Blanket) si sviluppano granuli
con biomassa strati-ficata in cui sono
particolarmente effi-cienti gli scambi
tro-fici tra i diversi m.o. (es.
metanogeni e acetogeni sintrofici).
L’ibridazione in situ con sonde
specifiche per Archaea (rosse) e per
Bacteria (verdi) mostra che gli strati
superficiali sono prevalentemente
colonizzati da batteri, mentre gli strati
profondi dei granuli sono colonizzati
da archaea, sia in granuli mesofili
che termofili. La parte centrale dei
granuli non da segnale di ibridazione
e sembra costituita da residui
cellulari e materiale inorganico.
M.saeta (rosso) Eubacteria
(verde)
M.saeta (rosso) Eubacteria
(verde)
MESOFILI
M.sarcinaceae (rosso) Eubacteria (verde)
METANOGENESI: I REATTORI UASB
M.microbiaceae (rosso) Eubacteria (verde)
TERMOFILI
M.bacteriaceae (rosso) Eubacteria (verde) M.bacteriaceae (rosso) Eubacteria (verde)
ARC915: sonda universale per Archaea ( fluorescina)
SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina)
SYN-7
ARC915+SYN-7
ARC915: sonda universale per Archaea (fluorescina)
EU338: sonda universale per Bacteria (rodamina)
MX825:
sonda spec. per Methanosaeta sp. (rodamina)
MG1200: sonda spec. per M.microbiaceae (fluorescina)
SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina)
ARC915+EU338+MX825
MG1200+SYN-7
METANOGENESI: I REATTORI UASB
ARC915
Sekiguki et al. 2001 Appl. Environ. Microbiol.,
67:5740-5749
INTERAZIONE METANOGENI-SOLFATORIDUTTORI IN UASB
L’interazione spaziale tra solfatoriduttori e metanogeni, 2 gruppi microbici che
competono per i donatori di elettroni diretti (acetato e H2) ed indiretti (es. lattato, etanolo,
ecc.) è stata studiata attraverso impiego di microsensori per CH4 e H2S, per misurare
negli strati di granuli UASB metanogenici e sulfidogenici-metanogenici, la
concentrazione dei 2 gas e l’attività metanogenica e sulfidogenica.
Granuli metanogenici-sulfidogenici
Granuli metanogenici
Le analisi di attività e di
microprofili dei gas
indicano
che
i
solfatoriduttori
si
posizionano negli strati
più esterni del biofilm,
mentre gli archaea
metanogeni
colonizzano il centro
del granulo. Questi
risultati
venivano
confermati
da
esperimenti
di
ibridazione “in situ”.
STABILITA’ DELLA BIOMASSA
FAVORIRE:
Biogas
Bassa idrofobicità superficiale biofilm
Effluente
Batteri a superficie idrofilica sulla superficie del
biofilm
Washout
Influente
Washout
1 cm
WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE
La stabilità dei granuli è determinata dall’interazione con le microbolle di gas e quindi
dalla tensione superficiale all’interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i DG di
adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni
interfacciali:
Ad alti carichi organici ed alte
produzioni di biogas la
biomassa granulare inizia a
flottare ed è trasportata fuori
dal reattore con il fenomeno
del wash-out della biomassa
WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE
La maggior parte degli acidogeni sono IDROFILICI,
mentre la maggior parte dei metanogeni e degli
acetogeni sono IDROFOBICI
WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE
La stabilità dei granuli è determinata dall’interazione con le microbolle di gas e quindi
dalla tensione superficiale all’interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i DG di
adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni
interfacciali:
C’è quindi una finestra
ottimale
di
tensione
superficiale del liquido che
aumenta
l’esposizione
di
batteri idrofilici sulla superficie
dei granuli e abbassa i valori
di DG di adesione per i
microganismi idrofilici
WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALE
La configurazione dei granuli UASB in relazione alla tensione superficiale del reflo e in
accordo a considerazioni termodinamiche può essere così schematizzata:
La configurazione 1 risponde anche al flusso trofico
che deve essere stabilito tra l’esterno e l’interno del
granulo. All’esterno del granulo è abbondante il
glucosio e gli zuccheri substrati del primo gruppo
trofico della metanogenesi, gli ACIDOGENI che
sono idrofilici
LA METANOGENESI
Acidogenesi
POLIMERI
1
MONOMERI
1
Acetogenesi
ALCOLI SUCCINATO
LATTATO
ACIDI GRASSI C2 C3
2
COMP. C1
H2
ACETATO
3
4
5
CH4 CO2
Metanazione
Produzione
di
idrogeno
scorporando
le
fasi
di
acidogenesi da quella di
metanazione per favorire la
produzione fermentativa di
idrogeno
PRODUZIONE DI IDROGENO
PRODUZIONE DI IDROGENO
Produzione di idrogeno da
reflui
solidi
scorporando
acidogenesi da metanazione
in due reattori con diverso
tempo di ritenzione
PRODUZIONE DI IDROGENO
Aumento
dell’accumulo di
idrogeno
attraverso
“sparging” di gas
nel reattore
Aumento delle
rese di metano
nel rattore
metanogenico
Grazie per l’attenzione !