Biochimica clinica Prof Barbetti Diebete Medicina 2013
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Biochimica clinica Prof Barbetti Diebete Medicina 2013
Laurea in Medicina e Chirurgia Anno accademico 2013-2014 Biochimica/biologia molecolare clinica e diabete Prof. Fabrizio Barbetti Biochimica/biologia molecolare clinica del diabete: obiettivi della lezione • • • • • • • • Fornire la definizione di diabete Ripercorrere i meccanismi di controllo della glicemia Descrivere la classificazione eziologica Descrivere il supporto del laboratorio alla diagnosi del diabete e degli stati intermedi di alterato metabolismo del glucosio Descrivere il supporto del lab. all’inquadramento su base eziologica Descrivere il supporto del lab. al monitoraggio della terapia Descrivere il supporto del lab. al monitoraggio delle complicanze acute del diabete Descrivere il supporto del laboratorio al monitoraggio della complicanze croniche del diabete Definizione di diabete mellito • “Un gruppo di disordini metabolici eterogenei dal punto di vista clinico e genetico caratterizzati da elevati livelli ematici di GLUCOSIO” • Nella classificazione corrente si distinguono due tipi principali di diabete: • il tipo 1 (T1D, distruzione immuno-mediata delle cellule pancreatiche). • il tipo 2 (T2D, conbinazione di “insulino resistenza” e deficit insulinico risultanti sia da fattori genetici che ambientali). • T1D + T2D: >95% dei casi Il controllo fisiologico dei livelli ematici del glucosio • Il glucosio ematico è regolato entro limiti stretti. • Il controllo fisiologico della glicemia è -tra l’altro- finalizzato al mantenimento di livelli minimi di glucosio durante la fase di digiuno notturna. 1 H-C=O 2 H-C-OH 3 OH-C-H 4 H-C-OH 5 H-C-OH 6 CH2OH D-Glucosio Somatostatina Glicemia 70 mg/dl 120 Glucagone Isola pancreatica + Insulina Glucosio + + + Gluconeogenesi Glicogenolisi FEGATO TESSUTO ADIPOSO MUSCOLO SCHELETRICO Somatostatina Glicemia 400 mg/dl 600 Glucagone Isola pancreatica + Insulina Glucosio + 2+ + + Gluconeogenesi Glicogenolisi FEGATO TESSUTO ADIPOSO MUSCOLO SCHELETRICO La “soglia” renale • I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si “satura” il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale: mediamente attorno a 180 mg/dl. • Primo dosaggio affidabile della glicemia su sangue intero: Folin-Wu (1920). Primi inibitori della glicolisi: 1931. I primordi della biochimica clinica: il “dosaggio” (!?!) della glicosuria nella diagnosi di diabete • Diagnosi rara nell’ ‘800: su circa 48.000 ricoveri al Massachussets General Hospital tra il 1824-1898, solo in 172 casi (0,004%) venne emessa diagnosi di diabete. Metodo analitico: far assaggiare al medico interno le urine del paziente. Dosaggio della glicemia: raccolta e conservazione del campione • Il dosaggio del glucosio in laboratorio è effettuato su siero o plasma (il sangue intero è utilizzato nell ’ autocontrollo domiciliare e fornisce valori più bassi del 12-15%). • Poiché la glicolisi diminuisce la concetrazione di glucosio ad un tasso del 5-7%/h a temperatura ambiente, si aggiungono al prelievo inibitori della glicolisi come il sodio fluoruro (NaF), in grado di stabilizzare i livelli di glucosio per almeno 3 giorni a temperatura ambiente ed un anticoagulante (ossalato di potassio). Diabete tipo 2: rilevanza della diagnosi • T2D= circa 90% di tutti i casi. Insorge tipicamente > 50 anni di età ed ha una elevata morbidità e costo sociale. • L’aumento della prevalenza di T2D correla con l’aumento dell’obesità. • 30-35% degli individui con T2D sono asintomatici ed inconsapevoli della malattia. • L’iperglicemia asintomatica può precedere di molti anni (fino a 10) l’esordio clinico e correla con il rischio cardiovascolare. • Una significativa percentuale di pazienti con T2D (ca. 20% negli USA) presenta retinopatia diabetica alla diagnosi. Le lesioni della retinopatia diabetica sono uniche La severità delle lesioni aumenta nel tempo Le complicanze alla diagnosi come indicatore di malattia silente: la retinopatia • La retinopatia diabetica può essere presente alla diagnosi e correla con gli anni di malattia. Estrapolando i dati è evidente che il diabete tipo 2 può essere presente almeno 6.5 anni prima dei sintomi clinici (e oltre !). Diabete mellito: criteri diagnostici ADA* e WHO § • Criteri ADA*/WHO§ • Sintomi classici di diabete e un valore di glicemia venosa plasmatica “casuale” =/> a 200 mg/dl (*, §). • Glicemia a digiuno >126 mg/dl (per 2 volte) (*, §). • Glicemia =/>200 mg/dl al tempo 120’ dell’OGTT (§, [*]). • Categorie a rischio: • IGT (alterata tolleranza al glucosio): coloro che hanno una glicemia plasmatica a 120’ dell’OGTT >140 e <200 mg/dl (§, [*]). • IFG (alterata glicemia a digiuno): coloro che hanno una glicemia a digiuno >100** e <126 mg/dl (*). ** RIVISTO NEL 2003 (precedente >110) Diabetes (): “passare attraverso” • 1964: il WHO stabilisce/propone i primi criteri diagnostici mediante il carico orale di “tolleranza” al GLUCOSIO (OGTT). • In Giappone: “Shoukachi” ovvero malattia della sete. • Primi del ‘900: test di “tolleranza” al RISO Carico orale di glucosio (OGTT): modalità. • OGTT “standard”: 75 g di glucosio (disciolto) per os e prelievi al tempo 0’ ed ogni 30’ per 2 ore. • Da effettuarsi solo se la glicemia a digiuno NON abbia già valore diagnostico. • Casi speciali. • Bambini < 40 Kg: 1.75g per Kg di peso corporeo. Il “caso speciale” per definizione: il diabete gestazionale • Screening del diabete gestazionale (USA) “two steps”: a)“minitest” (50 g), prelievi a 0’ e 60’. b)se >140 mg/dl a 60’, OGTT con 100 g x 3 h. • Screening “single step”: • OGTT con 75 g Problematiche del diabete in gravidanza • • • • Fetali 1° trimestre: malformazioni (aumento in %) 3° trimestre: macrosomia Nascita: IPOcalcemia, IPOmagnesemia, IPOglicemia • Materne (pazienti con diabete tipo 1) • Retinopatia ? -> Forse • Nefropatia ? -> probabilmente NO Criterio di scelta della glicemia a digiuno diagnostica di diabete da parte degli esperti ADA • Il valore di 126 mg/dl è stato scelto come “equivalente” in termini di sensibilità e specificità al valore di 200 mg/dl a 120’ dell’OGTT. Uso o non uso dell’OGTT nella diagnosi di diabete: conseguenze pratiche Cambiamento di prevalenza: non solo un problema metodologico • Boston, 1946. Campione: circa 70.000 persone. • Prevalenza diabete: 0.52 % • USA 2000 (stima WHO): 17.700.000 • USA 2030 (stima WHO: 30.3120.000 • Messico 2000 (stima WHO): 2.179.000 • Messico 2030 (stima WHO): 6.130.000 • Italia 2000 (stima WHO): 4.252.000 • Italia 2030 (stima WHO): 5.374.000 Il diabete tipo 1 • Il T1D è una malattia autoimmune organo specifica caratterizzata dalla distruzione delle cellule beta pancreatiche mediata dai linfociti T. • Esordisce tra l’infanzia e la pubertà, ma nessuna età è risparmiata. • L’esordio clinico è spesso brusco, con forte dimagramento, poliuria, iperglicemia elevata accompagnata da chetosi. Gli autoanticorpi circolanti confermano la diagnosi clinica • • • • • Islet Cell Antibodies (ICA) Glutamic Acid Decarboxylase Antib. (GADA) Insulinoma-associated protein 2 Antib. (IA-2A) Insulin autoantibodies (IAA) ZnT8 autoantibodies (ZnT8A) Ruolo degli autoanticorpi per la predizione del T1D • Il dosaggio degli autoanticorpi nei parenti di primo grado di soggetti con T1D combinato con la valutazione delle secrezione insulinica è un valido predittore di insorgenza di T1D. • Circa il 3-5% dei pazienti clinicamente T1D sono negativi al dosaggio degli autoanticorpi. Elevata percentuale di malattia celiaca nei pazienti con T1D • 6.8-8.3 % dei pazienti con T1D hanno la malattia celiaca, confermata con biopsia intestinale. • Di questi, circa il 70% sono sintomatici. • IgA antiendomisio (EmA) o anti-TG2 • (sensib.>90%, spec.>95% • Se IgA tot. <5 g/L-> IgG antigliadina (AGA) GENETICA del T1D e T2D • Entrambe malattie poligeniche (nessun andamento di tipo mendeliano) • Geni maggiori del T1D: 1) HLA; 2) VNTR del gene INS • Geni maggiori del T2D: polimorfismi del gene TCF7L2, moltissimi altri La famiglia “GCK/MODY 2” Glic.= 143 Età= 65 anni “Scoperta” = 39 aa Terapia=Dieta Complicanze=NO Glic.= 132 Età= 31 anni “Scoperta”= 24 aa Terap.=Dieta = Normale = mutazione GCK Glicemia= 118 Età= 6 anni Glicemia= 130 Età= 3 anni Le mutazioni GCK/MODY 2 (1) • Il gene della glucochinasi (GCK) è uno dei sette geni noti che causano un sottotipo monogenico di diabete mellito denominato MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young). • Il MODY si definisce come una condizione autosomica dominante in cui il diabete -non di tipo 1- insorge prima dei 25 anni di età. 2 2 Le mutazioni GCK/MODY 2 (2) • Le mutazioni della glucochinasi sono relativamente frequenti quando ricercate in una casistica pediatrica. • L’iperglicemia è modesta e NON progredisce nel tempo. • La diagnosi molecolare derime i dubbi nei famigliari del bambino portatore ed è utile per l’indirizzo terapeutico e della valutazione delle complicanze. Il diabete tipo 1: un esempio clinico. • Bambino di 14 anni con recente perdita di peso, poliuria, polidipsia, alito acetonico • Glicemia a digiuno: 318 mg/dl • Chetoni nelle urine: presenti (Ketostix +++, semiquantitativo= 80-100 mg/dl) • Diagnosi clinica: diabete tipo 1. • E’ una diagnosi corretta ? Il dosaggio degli autoanticorpi nel sospetto clinico di T1D in soggetti ad elevata familiarità • ICA • Decarbossilasi dell’acido glutamico (GAD65) • Islet antigen 2 (IA-2) • Insulina (IAA) Ab + T1D Ab probabile MODY3/HNF 1 = Diabete mellito ad esordio precoce (<40 anni) = Sospetto T1D Mutazioni MODY 3/HNF-1: possibili meccanismi di iperglicemia • Topo HNF-1 -/-. Ridotta espressione genica nella cellula di: • 1) Ins-1 (ma non Ins-2) • 2) Glut 2, GK • 3) Ipf-1/Pdx-1 • 4) NeuroD, HNF-4 Efficacia delle solfaniluree nei paz. MODY 3 SU started M stopped 11 SU stopped M started 9 8 7 6 5 Years from Diagnosis 13 13 .5 12 12 .5 11 11 .5 10 10 .5 9. 5 9 8. 5 4 8 HbA1c % 10 • Deterioramento della HbA1c-> 10.3% dopo cambio per metformina • Perdita di peso - 5.3kg • Ripristinata Glibenclamide 5mg • HbA1c 5.3% Pearson et al. Diab Med 2000 Casi sporadici con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ? • Neonato che alla terza giornata di vita esordisce con glicemia 400 mg/dl, chetoacidosi • Peso alla nascita: 2.400 g • Familiarità per diabete: nessuna KATP channels and insulin secretion regulation KATP channel activity KCOs sulphonylureas Ca2+ SUR1 KIR6.2 VDCC + _ K+ Glucose [Ca2+]i ATP/ADP Cav2.3 + KATP independent or augmentation pathway - prolonged 2nd phase insulin release + pulsatile insulin release KATP dependent or triggering pathway produce 1st phase insulin release Insulin weaning and transfer to SU in patients with KCNJ11 mutation MUT Age at “switch” Dose mg/kg/d HbA1c TX: Ins HbA1c TX: SU Dur. TX SU C-peptide nmol/L R50P 10a, 6m 0.57 7.2 6.3 10m 0.23 V59M 17m 0.5 9.8 5.2 7m 0.2 V59M 28m 0.39 9.2 5.8 14m 0.3 V59M 9a, 1m 0.18 8.0 5.4 12m 0.39 R201C 22m 0.32 7.3 6.7 12m 0.12 R201H 6m 0.47 6.4 5.4 2m 0.2* R201H 7m 0.37 7.9 4.9 4m 0.2 R201H 23m 0.16 7.1 5.5 1m 0.7* V59M 9a 0.55 7.7 5.8 6m 0.06 K170R 8a, 6m 0.61 8.4 7.4 14m 0.21 7.9 5.9 mean Tonini,…Barbetti, Diabetologia 2006 Casi PNDM da Mutazioni KATP nella casistica italiana (Ottobre 2012) • KCNJ11/Kir6.2= 26 • ABCC8/SUR1= 6 • Svezzati da insulina= 30 (93%) (di cui 3 adulti) Casi sporadici e non con insorgenza nei primi 6 mesi di vita:diagnosi ? • Neonato che al terzo mese di vita esordisce con glicemia 500 mg/dl, chetoacidosi • Peso alla nascita: 3.100 g • Familiarità per diabete: un genitore con diabete diagnosticato entro i primi due anni di vita NH2 M A L W M R L L P Signal peptide 3 2 1 N V F A A A P D P G W L A L L A 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 L V 4 3 21 A-chain L 1 L Q L A G G G L Insulin precursor R G P 30 20 29 19 28 Q 18 27 K 17 26 R C 16 B-chain G 15 25 s=s PC-2 14 24 13 T 12 K 11 P 10 T 9 Y 8 F 7 F 6 COOH C G S H L V E A L Y L V C G E R s=s s=s C C T S I C S L Y Q L E N Y C N G P L E V Q G C-peptide V E L D E A E L W M R L L P G W L A L L A 3 N 2 V 1 F A A 6 L 7 C 8 G s=s 9 S 10 11 12 13 14 15 16 17 18 H L V E A L Y L V C 7 I C 10 11 D P 19 20 C G s=s S L Y Q L E N Y C 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 E R N 21 Catena A PC-2 G 1 L R K Q L Pre (pro) Insulina Q L G G A L PC-1/3 G P G P G L E V Q G Peptide C V E L D E A E Catena B T S 8 9 s=s P 24 25 26 27 28 29 30 F F Y T P K T R C 6 A Peptide segnale COOH 3 4 V NH2 MA nd-PS/1: valori di C-peptide a 70, 90, 150 e 350 giorni dopo la scoperta dell’iperglicemia 10 nd-PS/1 (R65C) 8 6 C-peptide (ng/ml) 4 2 0,3 ng/ml 0 0 50 100 150 200 Days from birth 250 300 350 Insulina, IGF1 ed i loro recettori Taniguchi et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 85–96 (February 2006) | doi:10.1038/nrm1837 Mutazioni che aboliscono la funzione dello INSR causano la sindrome di Donohue (“lepreconismo”) Caso IR-NA/1: R974X/R974X Insulinemia: 4000 mU/ml (v.n. 2-20) I chetoni Insulina; Glucagone Insulina Glucagone (portale) Acidi grassi liberi plasmatici (FFA) Ossidazione epatica FFA Idrossibutirrato deidrogenasi epatica Acetoacetato ematico spontanea Acetone Idrossibutirrato Acetoacetato, Idrossibutirrato urinari I corpi chetonici si possono testare con strisce reattive • Il reagente è il nitroprussato di sodio • Reagisce con acido acetoacetico e con acetone, mnon con betaOH-butirrato • Range: 5-160 mg/dl Una complicanza acuta: la chetoacidosi diabetica (DKA) • Si verifica più comunemente: a) all’esordio del diabete tipo 1; b) durante infezioni; c) per la sospensione della terapia insulinica. • Parametri di diagnosi: • Glicemia >250 (solitamente molto più alta) • pH ematico: < 7.3 • Bicarbonati 18 mEq o meno • Chetoni > 5mEq (o chetonuria) • ESAME DA EFFETTUARE: EMOGASANALISI Gli “old-days” della biochimica clinica nel controllo metabolico: la “soglia” renale • I livelli plasmatici di glicemia raggiunti i quali si “satura” il meccanismo di riassorbimento del glucosio a livello del tubulo renale: mediamente attorno a 180 mg/dl. • Inibitori del cotrasportatore sodio-glucosio SLGT2 costituiscono una nuova classe di farmaci antidiabetici. Rilevanza della HbA1c come marcatore di rischio delle complicanze microvascolari • DCCT (T1D): -35% del rischio di progressione della retinopatia diabetica ad ogni decremento del 10% (ad es. da 8 a 7.2%) della HbA1c • UKPDS (T2D): -35% di rischio di progressione delle complicanze microvascolari ogni decremento di 1 punto percentuale (ad es. da 9 a 8%) della HbA1c “Biotecnologia di ritorno”: l’uso della HbA1c a fini diagnostici (2009) • HbA1c> 6.5%=diabete • Vantaggi: modeste variazioni intraassay, nessuna necessità di digiuno, stabile a RT • Svantaggi: risultati spuri in caso di condizioni che influenzano la vita media dei globuli rossi. La nefropatia diabetica • Insorge nel 35-45% dei casi con T1D • Insorge nel 20-35% dei casi con T2D • 1a causa di insufficienza renale e trattamento dialitico. • Insorge solitamente dopo 15-20 anni di malattia, ma può essere più precoce. • Se accertata nelle sue prime fasi, può regredire • Marcatore precoce la “microalbuminuria” Il ruolo della biochimica clinica nella valutazione della nefropatia diabetica. 1) L’aumento di escrezione urinaria di albumina (UAE) è un marcatore di alterazione microvascolare. 2) Una UAE aumentata è -a volte- presente nei pazienti con diabete tipo 2 alla diagnosi. 3) UAE > 20 mg/min è un fattore di rischio di sviluppare una nefropatia diabetica clinicamente evidente. 4) UAE nei soggetti con diabete tipo 2 è un predittore indipendente di aterosclerosi e mortalità cardiovascolare. Microalbuminuria: definizione • Valori compresi tra 30 e 300 mg/24 ore • La terminologia NON si riferisce ad una isoforma particolare di albumina, ma al fatto che i livelli di UAE non sono rilevabili dai comuni metodi colorimetrici con “stick” (in grado di misurare concentrazioni >200 mg/L), pur essendo i valori al di sopra della norma (<30 mg/24 ore). Microalbuminuria: ci sono basi strutturali ? R. Østerby, 1995 Ispessimento della membrana basale. Siti a carica negativa alterati (selettività di carica). Glicazione avanzata (?). Espansione delle cellule del mesangio e del contenuto di matrice. Microalbuminuria: ci sono basi strutturali ? S.C. Satchell, J.E. Tooke , 2008 Nel T1D la disfunzione endoteliale PRECEDE la microalbuminuria Glycocalyx è alterato dall’iperglicemia. Diminuzione “relativa” di podociti ? Difetti nella selettività di carica (e non della selettività per dimensione). Familiarità (genetica) per la nefropatia (es. ACE1) In modelli animali ruolo di: ROS, VEGF, IGF1 Ruolo dei podociti E.S. Stitt-Cavanagh, L. MacLeod, C.R.J. Kennedy, 2009 • Nel modello Akita mouse, correlazione tra perdita di espressione delle nefrina, “sparizione” e distacco dalla membrana basale coincidono con l’inizio dell’albuminuria • “Transizione” epitelio-mesenchimale del podocita con perdita dei contatti cellula-cellula, alterazione della polarità e riorganizzazione del citoscheletro. Microalbuminuria: quando, come. • Nei soggetti con T1D a partire da 5 anni dalla insorgenza della malattia. Controlli successivi con cadenza annuale. • Nei soggetti con T2D alla diagnosi e successivamente con cadenza annuale. • Metodi quantitativi: • Dosaggio radioimmunologico. Sensibile e preciso. • ELISA (“sandwich”). Microalbuminuria: problemi • - La UAE aumenta con: l’esercizio fisico l’ipertensione arteriosa la posizione eretta l’iperglicemia -> necessità di standardizzare la raccolta del campione.