Presentazione di PowerPoint

Servizio
PMA
U.O. Ostetricia e Ginecologia
Azienda Ospedaliera “Cannizzaro”
preservation
cryo
Maria Elena Vento
LA PRIMA BAMBINA NATA DA
FECONDAZIONE IN VITRO
Il 25 Luglio 1978 nasce in
Inghilterra Louise Brown
ASSISTED
REPRODUCTIVE
TECHNOLOGIES
m. vento
ICSI
m. vento
Le prime divisioni cellulari
Courtesy by Sathananthan
MATURITA’ NUCLEARE
m. vento
FECONDAZIONE
Courtesy by O’ Day
FECONDAZIONE
• aumento intracellulare del calcio
• esocitosi dei granuli corticali
• modificazione della Z.P. e blocco alla
polispermia
CARATTERISTICHE DELL’OVOCITA
• sensibilità
alle
ambientali
del
• cromosomi
esposti (fuso
meiotico)
• sensibilità
delvariazioni
citoscheletro
alle
calcio
intracellulare
modificazioni
della temperatura
OBIETTIVO
DELLA
CRIOBIOLOGIA
la sospensione di tutte le reazioni
biochimiche, metaboliche in modo da
produrre uno stato di“QUIESCENZA”
m. vento
CRIOBIOLOGIA
I processi vitali sono la conseguenza di
reazioni biochimiche che avvengono
grazie ai movimenti molecolari in H2O
Con la crioconservazione si crea uno stato
di “vita sospesa” che consente la
conservazione delle cellule.
Una volta che il sistema biologico viene
riportato a T ambiente si ha la ripresa
degli scambi molecolari senza che si
verifichino danni cellulari.
m. vento
CRIOBIOLOGIA
Cosa succede ad una
cellula quando
è
sottoposta
ad
un
abbassamento
della
temperatura?
Quali possono essere i
danni provocati dalla
procedura?
m. vento
CRIOBIOLOGIA
-5°C < t < -15°C
*
**
*
* *
Aumento
dei soluti
t inferiori
H2O
m. vento
CRIOBIOLOGIA
*
* **
*
* **
*
* **
m. vento
CRIOBIOLOGIA
• raffreddamento troppo rapido :
formazione di cristalli intracellulare
• raffreddamento troppo lento :
eccessiva disidratazione, precipitazione dei
soluti, “shrinkage”
m. vento
CRIOBIOLOGIA
Per molti tipi cellulari non è possibile
conciliare entrambe le esigenze senza
aggiungere al mezzo di congelamento
particolari
sostanze
definite
crioprotettori
Sono sostanze in grado di migliorare la
sopravvivenza delle cellule sia nella fase
di congelamento che in quella di
scongelamento
m. vento
STRATEGIE PER MIGLIORARE
LA SOPRAVVIVENZA DELLE
CELLULE
•
•
•
•
uso dei crioprotettori
“Seeding”
uso dei congelatori biologici programmabili
modulazione della velocita’ di scongelamento
m. vento
CRIOPROTETTORI
Molecole
di
piccole
dimensioni
la
cui
diffusione regolata dai
gruppi lipofili
Molecole di maggiori
dimensioni che non si
diffondono passivamente
attraverso la membrana
Intracellulari
Extracellulari
•GLICEROLO
• DMSO
• 1.2 PROH
•SACCAROSIO
•GLUCOSIO
•ROSSO D’UOVO
•LIPOPROTEINE
m. vento
CRIOBIOLOGIA
*
* **
sucrose
PrOH
H 2O
H 2O
m. vento
CRIOPROTETTORI
Meccanismo d’azione :
• Abbassano il punto di congelamento della soluzione
permettendo una maggiore disidratazione delle cellule
duranti la procedura di congelamento
Proteggono
le
membrane
cellulari
interagendo
con
esse
durante
il
raffreddamento e modificandone lo stato
fisico da fluido a “parzialmente rigido”
m. vento
CRIOPROTETTORI
CITOTOSSICITA’
Sono sostanze ad alto potere citotossico in relazione
alla dose e al tempo di esposizione.
m. vento
CRIOBIOLOGIA
*
***
seeding
CRIOPROTETTORI
SCONGELAMENTO
Deve essere rimosso gradualmente dalla cellula e per
minimizzare lo shock osmotico si aggiunge alla
soluzione di congelamento una sostanza non
penetrante come il saccarosio che, agendo come
pompa osmotica regola l’afflusso d’H2O all’interno
della cellula
m. vento
CRIOBIOLOGIA
• La curva ottimale di congelamento è specifica per
ogni tipo cellulare
• contenuto intracellulare di H2O
• permeabilità
• rapporto
di membrana
superficie / volume
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
INDICAZIONI
La crioconservazione del gamete femminile e/o del tessuto
ovarico rappresenta un metodo per preservare la fertilità
in giovani donne affette da alcune patologie il cui
intervento medicamentoso rischia di compromettere
definitivamente il loro patrimonio gonadico.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
INDICAZIONI
Un esempio è rappresentato da giovani pazienti affette da
neoplasie a carico del sistema emopoietico (morbo di
Hodking), carcinoma della cervice dell'utero, della
mammella, del colon, della tiroide e del fegato.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
INDICAZIONI
Questa strategia può essere anche applicata a giovani
donne affette da malattie infiammatorie ad eziologia
autoimmune come l'artrite reumatoide, il Lupus, e da
malattie infiammatorie idiopatiche intestinali, o
predisposte alla POF.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
INDICAZIONI
Il congelamento degli ovociti umani può essere
considerato un trattamento aggiuntivo per la cura
dell'infertilità perché consente il superamento di
problematiche
etiche
e
religiose
legate
alla
crioconservazione degli embrioni.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
INDICAZIONI
…può evitare i problemi legati alla sindrome da
iperstimolazione ovarica evitando ulteriori stimolazioni
ormonali in caso di mancato ottenimento della gravidanza
al primo tentativo.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
Chen 1986
Chen 1988
?
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
PRINCIPALI PROBLEMI RISCONTRATI ALLO SCONGELAMENTO
• un
gran
numero
di
poliploidie
• numerose ritenzioni del secondo globulo
polare
• danni ai granuli corticali
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
PRINCIPALI PROBLEMI RISCONTRATI ALLO SCONGELAMENTO
L’appropriata organizzazione
La distruzione dell’architettura
dei microtubuli
del fuso
L’aumento
delle aneuploidie
è
del citoscheletro può inoltre
meiotico adè essenziale
per
legato
errori
nellail
condurre alla ritenzione del
corretto allineamento
e per la
separazione
dei cromatidi
secondo
polar
body
o
segregazione
dei cromosomi
durante
l’estrusione
del
influenzare l’ingresso o la
quando polar
si ripristinano
valori
secondo
body
fuoriuscita di molecole e
ottimali di temperatura
organelli.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
DANNI SUBLETALI
microtubuli
mitocondri
granuli corticali
fratture z. p.
?
citoplasma
Sathananthan et al (1987;1988)
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
DANNI SUBLETALI
osservazione dello spindle mediante PolScope
Non
fornisce
informazioni
dettagliate circa l’organizzazione
dello spindle
ma rappresenta
comunque un metodo efficace e per
nulla invasivo per determinare la sua
presenza
Rienzi et al.2004
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
Metodiche di congelamento
• slow freezing
• vitrificazione
Metodiche di scongelamento
• rapido
m. vento
CRIOCONSEVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
VITRIFICAZIONE
Si basa sul
concetto
fisico della di crioprotettori
 Alte
concentrazioni
solidificazione
senza
possono evitare totalmente la formazione di
cristallizzazione di una soluzione
ad elevataghiaccio.
viscosità
 Ma una vitrificazione stabile richiede
elevate concentrazioni di crioprotettori (fino a
7.5M) che risultano estremamente tossiche.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
VITRIFICAZIONE vantaggi:
• procedura più rapida del convenzionale slow freezing
• non richiede seeding
• non richiede congelatori programmabili
• evita la formazione di cristalli di ghiaccio
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
Survival rates
Author
N° ovociti
% survived
Al – Hasani 1987
159
33.9
Gook 1994
134
41
Tucker 1998
311
24
Borini 2004
737
37
Yoon 2000 V
90
63
m. vento
CRIOCONSErVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
Survival rates
Author
N° ovociti
% survived
Porcu 2000
1502
54
Fabbri 2001 S
224
82
Yang 2002
158
70.9
Yoon 2003
474
68.6
Chen 2005 S
159
75
V
m. vento
RISULTATI CLINICI
Fertilizzazione
La % di fertilizzazione degli
ovociti dopo scongelamento
riportata in letteratura è molto
variabile
Le recenti esperienze (Yoon 2003; Fabbri 2001) che hanno
condotto ad un aumento della percentuale di
sopravvivenza riferiscono un miglioramento anche nella
% di fertilizzazione (67% e > 80%)
m. vento
RISULTATI CLINICI
Qualità Embrionaria
La letteratura non fornisce dati
rivelanti la qualità degli embrioni
ottenuti dal punto di vista
morfologico
m. vento
RISULTATI CLINICI
% Impianto
Soltanto circa 100 bambini sono nati con il congelamento
degli ovociti e tale valore riferito alla percentuale di
ovociti sottoposti a scongelamento è realmente molto
basso.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO
Oggi
la crioconservazione
del tessutoovarici
ovaricoe' rappresenta
La crioconservazione
di frammenti
applicabile
una
ambiziose
tentativo non
di
anchedelle
nel strategie
caso di più
pazienti
in età nel
pediatrica,
preservare
la fertilità
in ormonale
donne con
patologie
presuppone alcuna
stimolazione
dell'ovaio
e da
(prevalentemente
oncologiche)
in grado
di compromettere
una biopsia ovarica
è possibile
ottenere
centinaia di
la
riserva primordiali
follicolare ovarica
e le possibilità
riproduttive.che
follicoli
contenenti
ovociti immaturi,
risultano molto resistenti ai processi di congelamento e
scongelamento
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO
 Numerose cellule germinali
 Oociti immaturi e piccoli
Assenza della zona pellucida e del fuso meiotico
 Opportunità di riparare i danni durante la crescita
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO: prelievo laparoscopico
•la possibilità di essere effettuato con minimo
preavviso evitando così di dover posticipare
qualsiasi tipo di terapia oncologica;
•la bassissima percentuale di complicazioni intrae post-operatorie;
•la breve durata dell'intervento (15-20 minuti);
•l'assenza di esiti aderenziali a distanza in sede di
prelievo.
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO: prelievo laparoscopico
I frammenti possono essere prelevati incidendo
superficialmente la corticale ovarica mediante
forbici da laparoscopia o utilizzando uno
specifico strumento metallico studiato per
ottenere frammenti di 5 mm di diametro e 2-3
mm di spessore.
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO: prelievo laparoscopico
Se la paziente sara' curata con radioterapia pelvica
esclusiva e non con chemioterapia (es. per un
cancro della cervice uterina), e' anche possibile
autotrapiantare
temporaneamente
l'ovaio
in toto
in
Terminate le cure
radioterapiche,
l'ovaio
potra'
altra
(es. una
muscoli
essere sede
riportato
nella tasca
sua tra
sedei d'origine
dell'avambraccio)
unavascolare
microanastomosi
anastomizzando ileseguendo
peduncolo
ai vasi
vascolare.
infundibolo-pelvici.
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO: tecnica di congelamento
La maggior parte dei protocolli attualmente in uso
prevede il congelamento lento associato allo
scongelamento rapido. I frammenti ovarici, posti nel
terreno di congelamento all'interno di criotubi,
vengono raffreddati gradualmente mediante un
congelatore programmabile e successivamente
immersi in azoto liquido, ove possono essere
conservati per un tempo indeterminato
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO: % survival rates
La percentuale di sopravvivenza allo
scongelamento dei follicoli primordiali
varia nell'ovaio umano in base al
crioprotettore utilizzato: è dell‘84% nel
caso dell' Ethilen-Glicole (EG).
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO: scongelamento
?
Ottenere ovociti maturi
autotrapianto
xenotrapianto
Maturazione in vitro
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO:
Autotrapianto
ortotopico
Posizionamento
dei dimostrato
frammenti
ovaricidi
Oktay e colleghi hanno
la possibilita'
crioconservati
nellaframmenti
sede originaria
(fossetta
attecchimento dei
così trapiantati
e la
ovarica)
autotrapianto
per via
possibilità mediante
di
indurre
l'ovulazione
con
laparoscopica.
gonadotropine a distanza di 15 settimane e a sei
mesi dall'autotrapianto
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO:
Autotrapianto
ortotopico
La tecnica è finalizzata a ripristinare l'ovulazione
nella sede naturale dell'ovaio e offre teoricamente la
possibilità di ottenere un concepimento spontaneo
senza il ricorso a tecniche di fecondazione in vitro.
La fossetta ovarica però non è altamente
vascolarizzata e quindi essa non costituisce una
sede ottimale per il trapianto.
1° gravidanza 2004 Donnez et al
2°gravidanza 2005 Meirow et al
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO:
Autotrapianto
eterotopico
sede: avambraccio sotto il muscolo brachio- radiale
necessitano di IVF
nessuna gravidanza
rischio di ritrapiantare cellule neoplastiche
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
TESSUTO OVARICO:
xenotrapianto
animali di altre specie privati di "rigetto"
immunologico (SCID mice)
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
Maturazione in vitro
Maturation Medium
• FSH solution (final conc. 0.075 IU/ml)
• hCG solution (final conc. 0.1 IU/ml)
• Patient serum (10%)
• Equilibration for 2 –3 hours at 37°C and 5 – 6% CO2
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
Unstimulated IVM cycle
Day - 1
Day 3
Day 7 - 10
Day 8 - 11
US scanning
US scanning
US scanning
Blood sample
Blood sample
Blood sample
Day 0
Day +1
Day +2
Oocyte pick -up
estradiolo
progesterone
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE
Maturazione in vitro in cicli a fresco
• maturation rate ( 70 – 80%)
• fertilization rate ( 70 – 80%)
• cleavage rate
Fine 2006: circa
500 bambini nati
( 90 – 95%)
m. vento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
INDICAZIONI
Pazienti affetti da patologie che necessitano
di terapie inducenti danni
alla
spermatogenesi (patologie neoplastiche,
autoimmuni, ecc.)
•
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
INDICAZIONI
I principali tumori riscontrati nei pts che depositano
spermatozoi presso le banche sono i tumori testicolari
(seminoma, carcinoma embrionale, coriocarcinoma,
teratoma e tumori misti composti da più di uno dei
precedenti istotipi), linfomi di Hodgkin, non Hodgkin,
leucemie.
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
INDICAZIONI
 Pazienti
affetti da patologie che necessitano di
interventi chirurgici all’apparato urogenitale che possono
ledere la funzione eiaculatoria
• Soggetti che per motivi di lavoro sono esposti a
sostanze potenzialmente genotossiche
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
INDICAZIONI
• Pazienti che si sottopongono a vasectomia
• Pazienti con eiaculazione
retrograda
• Pazienti con lesioni del midollo spinale
• Pazienti inseriti nei programmi di F.A.
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
INDICAZIONI
• Pazienti con oligoastenoteratozoospermia (OAT) che
presentano transitori miglioramenti della qualità del seme
• Pazienti che mostrano un severo e progressivo
peggioramento della qualità del seme
• Pazienti criptozoospermici
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
INDICAZIONI
• Pazienti affetti da azoospermia
• Prelievo
testicolare
• Prelievo epididimario
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
QUANDO ?
Se il paziente deve subire trattamenti
antiblastici o radioterapia, entrambi induttori
di danno genotossico, è necessario eseguire la
crioconservazione prima dell’inizio di
qualsiasi trattamento
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
QUANDO ?
Se il paziente è già stato trattato con chemio o
radioterapici è opportuno attendere a scopo
prudenziale circa due anni dalla fine della
terapia stessa prima di effettuare una
crioconservazione
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
QUANDO ?
Nel caso di farmaci che non agiscono sul ciclo
cellulare è possibile fare crioconservazione dopo tre
mesi dalla sospensione del farmaco per utilizzare
gameti derivanti da una nuova spermatogenesi, se ciò
non interferisce con l’urgenza di iniziare un nuovo
ciclo di terapia.
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
QUANDO ?
Il periodo “finestra” utile per una
corretta crioconservazione è quello
tra
l’intervento
chirurgico
di
orchiectomia e l’inizio della chemio o
radioterapia.
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
ANALISI DA EFFETTUARE pre-crioconservazione
• Spermiocoltura e tamponi uretrali
• Virus EPATITE B: HBsAg
• Virus EPATITE C: Anticorpi anti – HCV
• HCV-RNA Qualitativo: (nel caso di anticorpi anti – HCV positivi )
• HIV: Anticorpi anti – HIV
• CITOMEGALOVIRUS: Anticorpi anti IgG, Anticorpi anti IgM
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
ANALISI DA EFFETTUARE pre-crioconservazione
• Virus EPATITE B: HBsAg
• Virus EPATITE C: Anticorpi anti – HCV
• HCV-RNA Qualitativo: (nel caso di anticorpi anti – HCV positivi )
• HIV: Anticorpi anti – HIV
• CITOMEGALOVIRUS: Anticorpi anti IgG, Anticorpi anti IgM
CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE
PERIODO DI ASTINENZA
Si consiglia un periodo di astinenza di 3 – 5 gg.
In caso di urgenza di inizio della terapia non viene
tenuto conto di tale limitazione
FATTORE DI CRIOSPERMIA
CSF
% di spz mobili
dopo
scongelamento
% di spz mobili
dopo
scongelamento
X 100
> 50 %
CONCLUSIONI 1
La preservazione della fertilità in pazienti che devono
sottoporsi a terapie antitumorali rappresenta
Mentre per la crioconservazione dei gameti maschili
un'esigenza fondamentale di un sistema sanitario
sono stati raggiunti traguardi soddisfacenti tali da
evoluto che si faccia carico anche della qualita' della
garantire buone percentuali di successo, ciò non è stato
vita futura dei pazienti.
raggiunto con i gameti femminili
m. vento
CONCLUSIONI 2
Anche se le tecniche attuali consentono di crioconservare
per lunghissimo tempo frammenti di ovaio umano con
• qual’è
la in migliore
per follicolare
impiegaredopo
i
buoni
risultati
termini di strategia
sopravvivenza
ovaricirimangono
dopo lo scongelamento?
loframmenti
scongelamento
irrisolti due problemi di
fondamentale
importanza:
• come ottenere
delle gravidanze senza rischiare di
reintrodurre nella paziente anche cellule tumorali?
m. vento
CONCLUSIONI 3
Le gravidanze recentemente ottenute dopo autotrapianto
del tessuto crioconservato, anche se casi isolati,
dimostrano
la fattibilità
di preservare
la fertilità time
femminile
"Now it's
time
to freeze,
con questa metodica e accendono la speranza per centinaia
todithaw
di migliaia
pazienti is coming“!!!
m. vento
U.O. Ostetricia e Ginecologia
Servizio
PMA
Azienda Ospedaliera “Cannizzaro”
Direttore: Prof. Paolo Scollo
Biologi della riproduzione
Maria Elena Vento
Adele De Palma
Ginecologi
Placido Borzì
Gabriella Poma
Maria Rita Garofalo
Ostetrica
Francesca Stimoli