Dispense psicobiologia applicata - Genetica molecolare e diagnosi

Quando il cariotipo non ce la
fa
GENETICA MOLECOLARE
INDAGA SULLA COMPOSIZIONE CHIMICA
STRUTTURA, PROPRIETA’ E FUNZIONAMENTO DEI GENI
La Citogenetica Molecolare
Abbina la possibilità di un’analisi del DNA, propria
delle tecniche di biologia molecolare, con la
struttura cromosomica il cui studio è oggetto
della citogenetica classica.
La Citogenetica Molecolare
• Permette
un’analisi mirata
di una regione
cromosomica
consentendo di
mettere in
evidenza
riarrangiamenti di
alcune centinaia
di chilobasi.
Tecniche di citogenetica
molecolare
• FISH (fluorescence in situ hybridization)
• PRINS (primed in situ labeling)
• PCR in situ (polymerase chain reaction
in situ)
• CGH (comparative genomic hybridization)
• ecc.
FISH (Fluorescence in situ
•È una tecnica di
ibridazione che
permette, dopo
fissazione di metafasi e
nuclei in interfase su
vetrino, di identificare
sequenze specifiche
negli acidi nucleici.
•Tale identificazione
avviene mediante
sonde marcate in
maniera non isotopica,
impiegando
fluorocromi che
emettono a diverse
lunghezze d’onda.
hybridization)
Nel cromosoma si distinguono:
ABERRAZIONI
TIPI DI SONDE
Sequenze ripetute
CROMOSOMICHE
IDENTIFICABILI
- Trisomie
- Monosomie
MATERIALE
IMPIEGATO
Nuclei in interfase
- Riarrangiamenti
Painting
cromosomici
- Identificazione di
Metafasi
cromosomi marcatori
- Microdelezioni e
Sequenze uniche
duplicazioni
- Riarrangiamenti
cromosomici
Metafasi e
nuclei in interfase
LA FISH IN DIAGNOSI PRENATALE
• Da 15 ml di liquido amniotico
metafase:
- Cariotipo
- FISH per diagnosi di
microdelezioni
- FISH per diagnosi di
riarrangiamenti
cromosomici
• Da 2 ml di liquido amniotico
nucleo:
- FISH per diagnosi di sesso
FISH per anomalie numeriche
DIAGNOSI DI ANEUPLOIDIE
FISH
VANTAGGI
SVANTAGGI
• rapidità
• identificazione di
microdelezioni e
riarrangiamenti
complessi
• diagnosi su nucleo
• costi elevati
• diagnosi non
completa
CHROMOSOME PAINTING
QF-PCR
Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction
(QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente
la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni
(trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi
sessuali)
Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari:
la diagnosi può essere completata in 2 giorni
Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi
sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti
di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono
specifiche per il cromosoma che si intende
analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13,
18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più
frequenti.
Quantitative Fluorescent PCR
Trisomy detection in prenatal samples
Hypervariable
region on
chromosome 21
amplified by FPCR
Ratio:
Ratio:
1
:
1 :
1
2
:
1
Quali sono i campioni
biologici più frequentemente
reperibili sulla scena di un
crimine?
Ma anche da utilizzare per
effettuare analisi genetiche?
REPERTI DA CUI E’ POSSIBILE ESTRARRE IL DNA
• sangue
• liquido seminale
• tessuti organici
• saliva
• sudore
• ossa
• denti
• fibre pilifere
• urina
• feci
IL DNA fingerprinting è attualmente la tecnica più
potente per identificare un campione biologico.
Viene utilizzata dal 1984 in medicina forense
(medicina legale) per risolvere casi legali:
attribuzione di paternità, casi di omicidi, casi di
stupri, ecc.
La Genetica forense, ossia l’applicazione della
Genetica nella risoluzione dei casi legali, si avvale
della variabilità del genoma umano per identificare un
individuo, o meglio per attribuire un campione
biologico ad un unico individuo.
I marcatori polimorfici (soprattutto gli STR)
sono stati estremamente utili per ottenere una
prima mappa globale del genoma umano
L’utilizzo simultaneo della PCR e di traccianti
fluorescenti consente l’analisi simultanea (multiplex) di
moltissimi polimoprfismi
È stato recentemente dimostrato che il Ritardo Mentale
può essere causato da riarrangiamenti cromosomici subtelomerici
non evidenziabili mediante tecniche di citogenetica classica
ma mediante tecniche di citogenetica molecolare
a causa delle loro ridotte dimensioni.
Ritardo mentale
• Patologia eterogenea ad etiologia mista
costituita da un numero molto elevato di entità
nosologiche differenti, le cui cause sono solo in
parte note.
• Prevalenza nella popolazione generale si aggira
attorno al 2-3%; la grande maggioranza rientra
in ritardi di modesta entità, mentre lo 0.3-0.4%
della popolazione generale presenta un ritardo
severo.
CGH convenzionale e microarray
Screening dell’intero genoma
CGH convenzionale
• Risoluzione di circa 10
Mb
Array-CGH
• Risoluzione teoricamente
illimitata
Array-CGH o Molecular Karyotyping
Caratteristiche generali
• La risoluzione dipende dalla distanza genomica tra gli elementi
sull’array e dalla loro dimensione
• La sensibilità è influenzata dal rapporto segnale/rumore
• L’intensità del segnale è determinata dalla complessità del DNA
contenuto negli spot e dalla qualità del campione
Vantaggi
• Indipendenza da cellule in divisione
• Capacità di analizzare l’intero genoma in un esperimento
• Elevata specificità, sensibilità e risoluzione
• Rapidità
Array – CGH o Molecular Karyotyping
Svantaggi
• Incapacità di rilevare riarrangiamenti bilanciati e
poliploidie
• Limitata abilità di individuare mosaicismi
Fattori tecnici influenti
• Specificità e intensità dei segnali di ibridazione
• Quantità e qualità del campione di DNA
Fattori biologici influenti
• Sequenze altamente ripetute e disperse
• Presenza di low-copy repeats (LCRs)
• Presenza di polimorfismi del numero di copie (LCVs)
Applicazione dell’array-CGH ai casi
di ritardo mentale
L’estensione dell’array dalla ricerca alla diagnosi richiede
attendibilità e interpretabilità dei risultati
•Conferma degli esperimenti tramite FISH (BAC)
•Estensione dell’analisi ai genitori
•Cautela nell’interpretazione di singoli cloni (oligo)
Utilità dell’applicazione ai pazienti con RM:
Descrizione del difetto molecolare
Identificazione dei geni
Migliore classificazione
Diagnosi
Nuove terapie
E’ possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cm2
Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi
identici
Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PM) è presente un oligo
identico con mismatch per una sola base in posizione centrale (MM)
La presenza di un MM consente di
stimare legami aspecifici e background
locale e di sottrarli dal segnale di PM
SNPs-array (Affymetrix GeneChip 250K)
•Risoluzione di 5 Kb
•250,000 SNPs
Intensità di segnale rilevata da uno scanner e i dati elaborati da un
software
Diagnosi
prenatale
• La diagnosi prenatale comprende
l’insieme
delle
procedure
che
permettono di riconoscere o escludere la
presenza nel feto di anomalie congenite.
Test rapidi in diagnosi prenatale
Vantaggi
• Tempi rapidi di risposta
• Risultato entro 2-3 giorni
• Il rischio di falsi positivi e falsi
negativi riportato in letteratura è basso
• E’ necessario poco materiale di
partenza
• QF-PCR è meno costosa e laboriosa
della FISH e della citogenetica
classica
• QF-PCR può essere automatizzata
• La QF-PCR può essere eseguita anche
se nel campione è presente una certa
contaminazione da sangue materno
Svantaggi
• Identificano solo le
aneuploidie dei cromosomi in
analisi
• Non è in grado di
diagnosticare traslocazioni e
delezioni
• La contaminazione con DNA
materno può rappresentare un
problema
• La presenza di mosaicismo
fetale è un problema
• La FISH non si può eseguire
se è presente una piccola
contaminazione da sangue
materno
DIAGNOSI PRENATALE
Dati recenti indicano che circa il 2-5% dei
neonati è affetto da una malattia genetica
• Lo scopo della diagnosi prenatale (DP) è
quello di offrire ai genitori e al medico le migliori
informazioni possibili sui rischi di dare alla luce
un bambino affetto da un'anomalia congenita o
da una malattia genetica.
• Due tipi di tecniche di DP : invasive e non
invasive.
Esistono 4 gruppi di patologie per le quali
esiste la possibilità di effettuare la DP:
- Anomalie cromosomiche;
- Malattie
genetiche
(errori
metabolismo, emoglobinopatie..);
- Infezioni fetali;
- Malformazioni fetali
del
LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO
Diagnosi preimpianto
Il materiale cellulare prelevato dagli oociti o dall’embrione coltivato in vitro è esaminato in
relazione ad una determinata anomalia genetica. Dopo la diagnosi gli embrioni non affetti (ma
non sempre…) sono selezionati e trasferiti nell’utero.
 1990 prima applicazione per determinazione del sesso in malattie X-linked
 1992 prima nascita di un embrione selezionato (fibrosi cistica)
Biopsia dei corpi polari
 l’oocita maturo è dotato di un primo corpo polare (meiosi I) che può essere prelevato per evidenziare
l’assetto cromosomico o l’allele in un gene patologico
 il secondo corpo polare può essere prelevato dopo la fertilizzazione in vitro per confermare la diagnosi
Biopsia dell’embrione
 allo stadio di divisione di 8-12 cellule (3° giorno) una o due cellule possono essere prelevate senza
arrecare danno all’embrione
 dopo la diagnosi, gli embrioni selezionati possono essere trasferiti in utero
 in alternativa biopsia allo stadio di blastocisti (300 cellule circa, 4°-5 giorno), ma è difficile coltivare in
vitro l’embrione sino a questo stadio
• Efficacia nella diagnosi : 93-95% (non 100%)
• Eventuale contaminazione con materiale
cellulare esterno
• Non si esclude la presenza di malattie
cromosomiche non ricercate.
• Si consiglia conferma della diagnosi con
Villocentesi / Amniocentesi
Legge 19 febbraio 2004, n. 40
Art. 13 È vietata…ogni forma di selezione a scopo eugenetico degli embrioni e dei gameti… ad
eccezione degli interventi aventi finalità diagnostiche e terapeutiche…volte alla tutela della
salute e allo sviluppo dell'embrione stesso
Diagnosi genetica pre-impianto
Diagnosi genetica pre-impianto
Diagnosi genetica pre-impianto
Possibile già oggi per malattie monogeniche per cui
sia nota la mutazione
In futuro, almeno in teoria, è probabile che questa
tecnica, in combinazione con l’analisi simultanea di
moltissimi polimorfismi, possa permettere una
valutazione di tratti genetici complessi.
Quali i vantaggi, e quali i pericoli?
LA DIAGNOSI PRENATALE POSTIMPIANTO
• Negli ultimi 50 anni è aumentata in modo
esponenziale la richiesta di indagini che durante
la gravidanza permettano il riconoscimento di
difetti o malformazioni fetali.(3% pop gen)
• Aumentate conoscenze scientifiche su
malformazioni e difetti genetici e rischio genetico
• Aumentata capacità diagnostica
• Riduzione del numero di figli/coppia nel mondo
industrializzato
• Richiesta esplicita di “figlio sano”
• Ricerca tardiva del primo concepimento
• Legislazioni su IVG
LA DIAGNOSI PRENATALE
POST-IMPIANTO
• INVASIVA
• PRELIEVO VILLI
CORIALI (CVS)
• AMNIOCENTESI
• CORDOCENTESI
• FETOSCOPIA
• NON- INVASIVA
• ECOGRAFIA
(Soft markers)
• BI-TEST
• TRI-TEST
• RICERCA SANGUE
FETALE NEL PLASMA
MATERNO
LA DIAGNOSI PRENATALE POSTIMPIANTO NON INVASIVA
• BI-TEST/ DUO-TEST.
• Screening biochimico: dosaggio su sangue materno
BHCG e PAPP-A + esame ecografico per datazione
• Si esegue alla 10°-14° settimana
• Aumento HCG e diminuzione PAPP-A
aumentato
rischio di SDR Down
• Attendibilità al 60%
• DUO TEST + NT 80%
LA DIAGNOSI PRENATALE POSTIMPIANTO NON INVASIVA
• TRI-TEST:
• Screening biochimico:dosaggio su sangue
materno di alfa fetoproteina+ BHCG+estriolo
non coniugato
• Associato ad esame ecografico per datazione
• AF ridotta (25-30%)+ BHG aumentata+estriolo
ridotto
aumentato rischio SDR Down
• Attendibilità al 60%
SCREENING PRENATALE
L’AFP ( alfa feto proteina) è prodotta nel sacco vitellino e nel fegato
fetale ed una parte di questa sostanza si trova anche nel sangue
materno. In tutte le lesioni di continuo della cute quali spina bifida
aperta, gastroschisi, estrofia vescicale LPS etc. una maggiore
quantità può essere rilevata nel sangue materno.
Questa indagine è pertanto utilizzata per verificare queste condizioni
che potranno poi essere confermate anche con l’ausilio della
indagine ecografica.
In presenza di un feto con S. di Down, l’AFP è ridotta nel sangue materno,
presumibilmente perché sia il sacco vitellino che il feto sono più piccoli.
L’ESTRIOLO è un ormone prodotto dalla placenta che utilizza precursori
derivati dal fegato e dalla surrenale. L’estriolo è ridotto in presenza di un
feto con S. di Down
La GONADOTROPINA CORIONICA UMANA è prodotta dalla placenta
ed il suo dosaggio è utile a confermare una gravidanza in atto. Una
subunità di questo ormone, detta BETA aumenta in presenza di un feto con
s. di Down.
L’elaborazione dei valori di questi parametri e le conclusioni debbono
tenere conto però dell’età gestazionale che va definita mediante esame
ecografico.
LE TECNICHE DI DIAGNOSI NON INVASIVE
E' importante tenere presente che QUESTE
TECNICHE DI INDAGINE consentono di effettuare
quasi
esclusivamente
una
valutazione
probabilistica, cioè, non permettono di identificare
o di escludere direttamente le anomalie
cromosomiche ma di selezionare pazienti a basso e
ad alto rischio.
LE TECNICHE INVASIVE
- BIPOSIA VILLI CORIALI
- AMNIOCENTESI
- FUNICOLOCENTESI
- FETOSCOPIA
LE TECNICHE DI ANALISI
TECNICHE CITOGENETICHE
TECNICHE DI INDAGINE MOLECOLARE
TECNICHE IMMUNOLOGICHE
INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE
CITOGENETICHE
• madri di età avanzata: superiore a 35 anni
• coppie con precedenti figli affetti da patologia cromosomica
• genitori con anomalie cromosomiche bilanciate
• riscontro ecografico di malformazioni fetali, ritardo dello
sviluppo fetale, anomalie del la
• alterazione di alcuni parametri biochimici
• genitori portatori di aneuploidie non associate ad infertilità
• alcune malattie mendeliane
• gravidanze ottenute con fecondazione artificiale
INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE
BIOCHIMICHE E BIOMOLECOLARI
• malattie mendeliane, X-linked, mitocondriali per le quali è
stato identificato il difetto metabolico
• malattie mendeliane, X-linked, mitocondriali per le quali è
stato identificato il difetto genico
INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE
IMMUNOLOGICHE
• malattie infettive a trasmissione verticale contratte o
riacutizzatesi durante la gravidanza
Le più frequenti sono le malattie infettive del gruppo TORCH
Problemi nella diagnosi
prenatale
• 1. Possibilità che le cellule in coltura
non crescano in maniera adeguata e
non sia possibile effettuare la diagnosi
sul campione prelevato.
Presso i centri più qualificati questo
problema si verifica eccezionalmente,
in media in meno dell’1% dei campioni.
Problemi nella diagnosi
prenatale
• 2. Possibilità che l’analisi fornisca un risultato
ambiguo.
Questo può dipendere da una contaminazione
materna, che dà quindi origine alla presenza di due
linee cellulari, potenzialmente non differenziabili se il
feto è di sesso femminile, mentre di solito sono
facilmente evidenziabili se il feto è di sesso
maschile.
In altri casi può essere presente una seconda linea
cellulare originata da una mutazione in vitro. È
indispensabile riuscire a differenziare i campioni che
contengono
artefatti
della
coltura
(pseudomosaicismo) dai mosaicismi veri, in quanto
le implicazioni per il feto sono completamente
diverse (rispettivamente sano e ammalato).
Problemi nella diagnosi prenatale
• 3. Diagnosi certa ma implicazioni fenotipiche
incerte
Questo costituisce attualmente un
importante limite della diagnosi citogenetica
fetale. In pratica, a fronte di un risultato
diagnostico accurato a livello di laboratorio,
non è possibile in certi casi predire con
altrettanta accuratezza il fenotipo fetale. In
queste situazioni viene attribuito un rischio
empirico di patologia, che non è
ulteriormente precisabile.
The future
• Fetal cells in the maternal circulation
• Free fetal DNA in maternal plasma
• If diagnostic – no need for CVS or
amniocentesis to detect chromosome
abnormality
• Persistenza di cellule staminali fetali nel sangue e
tessuti materni per decadi postpartum (Bianchi,
‘96)
• Anticorpi monoclonali CD34  antigeni di
superficie di HSCs fluorescent activated cell
sorting+PCR amplification di Y  isolamento di
HSCs Y in 6 donne poratrici di feti femmine
• Isolamento di Y-DNA in cellule CD34+ di 6/8 donne
non gravide di cui la più anziana aveva partorito
un maschio 27 anni prima
Cellule ♂ nel sangue materno per lungo tempo dopo il parto
MICROCHIMERISMO
Fetomaternal trafficking and maternal health
Fetal cells  graft versus host disease??
• Nelson (96): microchimerismo  alcune malattie più
comuni nelle donne che negli uomini. Nel sangue periferico
di donne affette da sclerosi sistemica  cellule fetali ♂
• Identificazione di cellule fetali ♀ nel sangue materno con
polimorfismi familiari specifici o paterni
• Johnson () ha identificato con metodiche di FISH e sonde
per Y e X cellule fetali nei tessuti clinicamente affetti di una
donna deceduta per perforazione intestinale da LES :
milza, tiroide, rene, grosso intestino, polmone, cuore, cute
e piccolo intestino (> 500 cellule ♂)
• Successivamente in altre malattie: sclerosi sistemica, LES,
cirrosi biliari primario, sind Sjogren, Hashimoto, Graves e
lichen planus
Conclusioni da un ampio corpo di studi sul
microchimerismo umano dimostrano un
transfer di cellule fetali multipotenti verso la
loro madre
• Koopmans (05) con sonde Y-FISH ha
identificato cellule ♂ in campioni istologici di
donne sane (rene, fegato, cuore)
• Cellule di feti ♂♀abortiti persistono e ripopolano
i tessuti materni (fegato, reni) a distanza di 1719 anni Johnson (02)
Panel di 13 mutazioni usato per la
diagnosi prenatale
 F508
N1303K
G542X
W1282X
2183AA-G
1717-1G-A
I148T
R553X
86%
57%
7%
5%
3%
3%
2%
1%
1%
L1065P
G1244G
4016insT
R1158X
711+1GT
PECULIARI
DEL SUD
( 7%)
Indicazioni per la diagnosi prenatale
• Precedente figlio con patologia
cromosomica
Le coppie che hanno un figlio con
sindrome di Down da trisomia 21 libera
o con traslocazione robertsoniana de
novo hanno un rischio dell’1% circa di
ricorrenza della sindrome. Nelle coppie
attempate il rischio è quello calcolato
sull’età materna.
Indicazioni per la diagnosi prenatale
- Genitori eterozigoti
bilanciate
per
anomalie
I genitori eterozigoti per una
traslocazione bilanciata hanno un
rischio di patologia fetale sbilanciata
del 5-10%. Tuttavia tale rischio varia
ampiamente in rapporto al tipo di
riarrangiamento
Indicazioni per la diagnosi prenatale
• Identificazione ecografica di patologia fetale
o della gravidanza
in presenza di difetti strutturali e/o dello
sviluppo fetale o alterazioni del volume del
liquido amniotico.
In circa il 20% di queste gravidanze,
soprattutto quando sono presenti difetti
associati, il feto è affetto da una patologia
cromosomica. Il riscontro di anomalie
ecografiche costituisce perciò un’indicazione
al monitoraggio del cariotipo fetale.
Indicazioni per la diagnosi prenatale
- Anamnesi familiare positiva per difetti
del tubo neurale
- Anamnesi
familiare
positiva
per
malformazioni congenite
• Malformazioni e/o rimozioni chirurgiche
dell’ovaio o parti di esso (RR DS + 9.6)
• Malattie mendeliane
Effetti delle mutazioni
•
•
•
•
•
•
•
•
Letali
Subletali
Condizionali
Neutre
Silenti
Vantaggiose
Svantaggiose
Pleiotropiche
Il 100% muore prima dell’età riproduttiva
Il 50% muore prima dell’età riproduttiva
Restrittive e permissive
Non hanno effetti sul fenotipo
Inalterata la proteina genica (polimorfismi)
Favoriscono cambiamenti favorevoli
Effetti fenotipici  malattia
Singole mutazioni diversi caratteri
“Early”: 10-14 sett
“Mid”:15-18 sett
“Tardiva”:II-III trim
•Indicazioni
•Controindicazioni
•Tecnica
•Complicanze
counselling
Le fonti del liquido amniotico
•10 sett
il volume medio di LA 
30 ml
•incremento di 20 ml/sett  alla 14a sett
(accumulo di LA  gradiente osmotico tra feto-cav amniotica)
•16 sett. volume medio di LA  200 ml
dopo la 14a sett la deglutizione e la minzione diventano
significative ed il volume medio di LA si raddoppia
Tessuti che contribuiscono alla popolazione cellulare del LA:
•desquamazione di cellule da organi fetali, amnios e cordone.
•20% di cellule viabili
•fibroblasti  maggiore capacità riproduttiva
“early” o “mid”
•Cariotipo fetale
•Analisi genetiche molecolari
•Dosaggio di analiti ( FP, etc)
•Diagnosi di malattie infettive fetali
“tardiva”
•Maturità polmonare fetale
•Evacuazione polidramnios
•Amnioinfusione
Amniocentesi : indicazioni
(GU n.245 del 20/10/1998)
• Età materna avanzata  35 a
• Genitore con precedente figlio affetto da patologia
cromosomica
• Genitore portatore di riarrangiamento strutturale non
associato ad effetto fenotipico
• Genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali
compatibili con la fertilità
• Anomalie malformative evidenziate con USG
• Rischio aumentato di feto affetto da s. di Down in base
al triplo test (1/250) o su screening USG attuati sulla
base di specifici programmi regionali.
Controindicazioni
• Assolute: nessuna vera.
• Relative:
problematiche tecniche (sovrapposizione di
anse intestinali, miomi etc.)
Infezioni materne (HIV, epatiti???)
Amniocentesi: fase preliminare
• Accurato counselling della gestante su
tutti gli aspetti dell’esame per un
consenso realmente informato
• Adeguato supporto psicologico
• Paziente in posizione supina (adeguato stato
di riempimento vescicale)
• Ecografia
• Disinfezione dell’addome
• Eventuale anestesia locale
Ecografia per l’amniocentesi
Viabilità fetale
Numero di feti
Eventuali anomalie
Topografia placentare
Età gestazionale
Volume di LA
Tasca di LA utile per il
prelievo.
Amniocentesi
Procedura
1.
2.
Disinfezione cutanea;
Infissione eco-guidata di un ago
sterile munito di mandrino (20-22G
di diametro e 7-12 cm di
lunghezza) mediante tecnica a
“mano libera”, in cui l’operatore
tiene in una mano la sonda e
nell’altra l’ago in modo da dirigere il
fascio d’ultrasuoni sul piano
d’inserzione dello stesso e
visualizzarlo in tutta la sua
lunghezza, oppure “ago-guidata”, in
cui l’ago è fissato al trasduttore e
percorre una traiettoria fissa
(l’operatore visualizza solo la punta
dell’ago);
Amniocentesi
PROCEDURA
3.
4.
Giunto in cavità l’ago,
estrazione del mandrino
ed aspirazione con siringa
sterile di 15-20 ml di
liquido amniotico
(è preferibile eliminare i
primi 1-2 ml di liquido
amniotico in quanto
potenzialmente contaminati
da tessuto materno);
Estrazione dell’ago e
controllo del battito
cardiaco fetale.
Complicanze immediate
Procedurali :
• Prelievo difficile
(dry tap, bloody tap, ripetizioni)
Postprocedurali
• Contrazioni dolorose
• Bleeding
• Perdite di LA
Rischi materni
Infezioni
Iso-RH
Ansia
Infezioni materne
•Amnioniti : 1/8000 Crane (1983)
0.1% Turnbull (1983)
1/1000 Schemmer (1993)
•Forme subcliniche ???
•Complicanze mortali: rischio inesistente
e non calcolabile
Procedura
non sterile
Contaminazione
secondaria a
lesioni intestinali
Altri rischi materni
• Iso-Rh : rischio di emorragia feto-materna in
amniocentesi non complicate è 11% (Tabor,
1986)
Immunoprofilassi antiD
<20 sett : 250 IU IgG anti D
>20 sett : 500 IU IgG anti D
(raccomandazione grado B - RCOG, 1999)
• Ansia : lo stress psicologico è comune ed è
dipendente dalle indicazioni e dal
counselling
Rischi fetali
Danni diretti:
perdite fetali,
traumi
Morbilità da
rimozione del LA:
respiratoria,
ortopedica
esperienza dell’operatore
In uno studio danese su 3000 gravidanze Leschot 1985 ha
trovato una FLR di 1.53% per le prime 1500 A e di
0.47% per le successive
Traumi fetali
• La reale incidenza di traumi diretti fetali è
sconosciuta
• Studi di follow-up neonatale suggeriscono 2-9%
di lesioni cutanee minori (Epler 79)
• Isolati gravi danni sono stati descritti: testa,
porencefalia, cecità unilaterale, danni intestinali
(atresia ileale con fistola ileocutanea), arti
inferiori, infarto di un braccio, rottura del tendine
patellare, lesioni di nervi periferici
INDICAZIONI:
Prelievo dei Villi Coriali
Determinazione del cariotipo fetale
•
•
•
•
età materna avanzata (>35 anni);
genitore portatore di arrangiamento
cromosomico strutturale;
genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali compatibili
con la fertilità;
• precedente figlio con malattia cromosomica;
• malformazioni fetali rilevate all’esame ecografico;
• test ecografico o biochimico che indichi un rischio elevat
per sindrome di Down o altra anomalia cromosomica;
Esame del DNA fetale
Studio di attività enzimatiche
Prelievo dei Villi Coriali
Prima del prelievo:
• Effettuare un adeguato counseling
• Far firmare il modulo del consenso
informato;
• Eseguire un controllo ecografico
per valutare numero e vitalità
dell’embrione/i, rilevarne la
biometria (CRL), localizzare il
chorion frondosum e scegliere il
punto più idoneo per l’inserzione
dell’ago.
Prelievo dei Villi Coriali
Modalità di esecuzione dell’esame:
•
Via transcervicale
mediante catetere di polietilene con
mandrino di alluminio o pinza da biopsia
rigida;
•
Via transaddominale
mediante ago di calibro di 20 Gauge e
lunghezza adeguata.
Prelievo dei Villi Coriali
Prelievo dei Villi Coriali
Complicanze
• Perdita fetale:
Il prelievo dei villi coriali comporta un rischio aggiuntivo
di perdita fetale dell’3%, correlato a diversi fattori:
età materna avanzata;
numero di tentativi di prelievo;
assetto citogenetico della placenta (mosaicismo);
epoca di gravidanza;
esperienza dell’operatore.
RCOG, 2005
Prelievo dei Villi Coriali
• Lesioni e malformazioni fetali:
Il prelievo dei villi coriali eseguito primo della 10a
settimana si associa ad un aumentato rischio di
malformazioni degli arti (soprattutto trasverse limb
defects) e di anomalie della regione oromandibolare
(ipoplasie oro-mandibolari).
• Altre complicanze:
Complicanze settiche (più frequenti in caso di
CVS-TC, rare in caso di CVS-TA);
Isoimmunizzazione Rh in caso di donne Rh
negative
con test di Coombs negativo (è opportuno
effettuare profilassi mediante iniezione di
immunoglobuline anti-D).
RCOG, 2005
Prelievo dei Villi Coriali
Successo e accuratezza diagnostica
• Successo del prelievo nel 98% dei casi al primo
tentativo, nel 99,8% con due tentativi;
• Fallimento dell’esame nello 0,5-1% dei casi per
scarsità del materiale prelevato;
• Falsi positivi dell’esame citogenetico nell’1% dei
casi circa per la presenza di mosaicismi
placentari (90%) e raramente per aneuploidie
non a mosaico;
• Falsi negativi degli esami citogenetici sono
rarissimi (1 su 3000) utilizzando la sola tecnica
diretta, eccezionali (1 su 20.000) utilizzando
l’analisi diretta insieme a quella colturale.
SIEOG, 2006
Cordocentesi
INDICAZIONI
• Studio dei parametri ematologici del feto per la diagnosi di:
difetti dell’emostasi (emofilia, trombocitopenia
alloimmune),
patologia ematologiche (anemia fetale su base
infettiva o per alloimmunizzazione materno-fetale);
• Determinazione rapida del cariotipo fetale (48-72 ore)
nei casi di:
mosaicismo o fallimento di precedenti prelievi,
positività di markers ecografici di cromosomopatia,
malformazione fetale potenzialmente associata a
cromosomopatia;
SIEOG, 2006
Cordocentesi
INDICAZIONI
• Terapie mediche fetali, quali:
somministrazione di sangue e/o piastrine,
somministrazione di farmaci antiaritmici in feti
con aritmie cardiache;
• Studio del DNA fetale;
• Ricerca di agenti infettivi.
Cordocentesi
Prima del prelievo:
• Effettuare un adeguato
counseling;
• Far firmare il modulo del
consenso informato;
• Eseguire un controllo
ecografico per valutare la
posizione del feto,
rilevarne la biometria,
localizzare la placenta e
scegliere il punto più
idoneo per l’inserzione
dell’ago.
Diritti umani e bioetica
• Diritti di I generazione (diritti civili: vita, libertà), nati per difendere il
cittadino dai poteri dallo Stato
• Diritti di II generazione (diritti sociali: salute, lavoro, istruzione,
informazione, ecc.), che invece richiedono l’incremento degli interventi
statali
• Diritti di III generazione (solidarietà, sviluppo, pace internazionale,
ambiente protetto, comunicazione, ecc.)
• Diritti di IV generazione ( diritti delle generazioni future, diritto ad un
patrimonio genetico non manipolato, ecc.)
Questi ultimi diritti toccano da vicino la bioetica che, tuttavia, li abbraccia
tutti (es. diritto alla vita nell’aborto, diritto alla libertà nella procreazione
assistita, ecc.), pur nella difformità di vedute dei diversi orientamenti
etici.
Il tema dei diritti è centrale in bioetica, anche perché parlare di diritti
significa elaborare un codice etico comune, in vista di un consenso
condiviso
Chi ha diritto ai Diritti?
• Ancora oggi “uomo” non è
per
tutti
sempre
l’equivalente di “persona”
(cioè soggetto di diritti),
come
vedremo
nella
prossima lezione
Modelli etici
Attualmente possiamo distinguere quattro modelli di
riferimento in bioetica, ognuno dei quali si caratterizza
per un differente criterio antropologico e, di
conseguenza, per una diversa formulazione del giudizio
etico:
MODELLO LIBERAL-RADICALE
MODELLO PRAGMATICO-UTILITARISTA
MODELLO SOCIO-BIOLOGISTA
MODELLO PERSONALISTA
Modello personalista
• Fondato sulla persona intesa come
realtà singola ma anche come l’insieme
delle persone
• Nasce dalla concezione filosofica
dell’uomo come persona, nella quale
l’universo
raggiunge
la
massima
espressione, mentre lo stesso mondo
materiale acquista il suo significato. La
persona umana ha, quindi, nel mondo un
primato, perciò anche la società va
considerata in funzione dell’uomo, non
viceversa
• Poiché la natura ontologica dell’uomo è
unità di corpo e spirito, la morale ed i
principi di riferimento del modello
Modello personalista
Le dimensioni fondamentali che qualificano l'uomo in quanto persona
sono:
• L'inscindibilità degli aspetti corporei - psichici - spirituali (il
corpo non è solo un complesso di organi e funzioni, ma espressione
visibile e luogo della realizzazione dell'uomo);
• La libertà e la responsabilità che nascono dall'intelligenza e dalla
volontà;
• L'eticità che deriva dalla naturale apertura al Valore Assoluto;
• Il diritto alla vita che è premessa indispensabile a tutti i diritti e i
valori;
• La relazionalità che rende ragione della dimensione sociale di ogni
problema umano (il problema morale ha sempre una dimensione
sociale)