Enzimi

LE PROTEINE POSSONO ESSERE BERSAGLIO DEI FARMACI
FARMACI
controllano l’attività
delle proteine
PROTEINE
svolgono molteplici attività
STRUTTURALI
mantenimento della forma della cellula
(microtubuli, microfilamenti)
organizzazione strutturale del DNA
(impalcatura del cromosomi)
…
FUNZIONALI
enzimi, implicati nel metabolismo
proteine recettoriali, informano la cellula
degli eventi esterni e sono essenziali per
l’attivazione della risposta intracellulare
fattori di trascrizione
…
LIVELLI DI ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE DEGLI ENZIMI
primaria
sequenza
amminoacidica
secondaria
terziaria
quaternaria
la struttura tridimensionale (3D)di
una singola catena ripiegata.E'
composta da elementi di struttura
secondaria regolare ed irregolare
la conformazione lungo la catena,
in particolare per quanto riguarda
segmenti con conformazione
regolare
(alfa-elica, beta-struttura ecc.)
aggregazione di due o più subunità
(catene) proteiche identiche (omo) o
diverse (etero)
Energia di attivazione
La conversione X --> Y è termodinamicamente favorevole (Y si
trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X), ma la
reazione non può avvenire se X non acquisisce sufficiente
energia per superare la barriera dell’energia di attivazione
Distribuzione di energia in una
popolazione di molecole
• Normalmente, le molecole stabili sono per lo più presenti ad un
livello di energia relativamente basso
• Solo una piccola frazione di esse possiede sufficiente energia
per superare la barriera dell’energia di attivazione
Enzimi: catalizzatori biologici
Reazione non
catalizzata
DG* Reazione
catalizzata
DG*
X
DG
Y
• Gli enzimi si combinano transientemente col substrato e ne
abbassano l’energia di attivazione
• Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la
velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto
• Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e
sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di
reazione
Struttura generale degli enzimi
ione metallico
coenzima (vitamina)
gruppo prostetico
(legato covalentemente)
OLOENZIMA
APOENZIMA
(Parte proteica)
V=K3 x [ES]
Vmax=K3 x [Etot]
M
K2 + K3 = Ks + K3
K1 + K1
K1
Misura efficienza catalitica
V0 = K3 x [Et] = Vmax
Kcat = Vmax = numero di turnover processi nell’unità di tempo
Et
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
la Km aumenta se l'affinità di E per l'inibitore è maggiore di quella di ES (a > 1),
la Km diminuisce se l'affinità di E per l'inibitore è minore di quella di ES (a < 1).
M
M
M
M
M
M
M
M
Reazioni a due substrati
S1 + S2
P1 + P2
Bi—Bi
Uni-Bi
Uni-Ter
Meccanismi Sequenziali
Le reazioni sequenziali sono quelle in cui tutti i reagenti si legano
all'enzima prima che venga rilasciato il prodotto e possono venire
suddivise in due sottoclassi, reazioni ordinate e reazioni casuali. Nel
primo caso i reagenti si legano e i prodotti sono rilasciati secondo una
sequenza obbligatoria, mentre nel secondo caso non esiste una sequenza
di legame obbligatoria.
Meccanismi a Ping-pong
Le reazioni a ping-pong sono quelle in cui almeno un prodotto
viene rilasciato prima che tutti i substrati si siano legati
Grafici di Lineweaver-Burk
Si consideri un grafico per un enzima che usa un meccanismo sequenziale:
Qui A agisce da substrato variabile. Sono usati cinque valori di concentrazione
di fisso, B, e ognuna dà cinque intercette con gli assi 1/v e 1/[A]. Questi
rappresentano differenti valori apparenti di 1/Vmax and 1/KA. I valori veri
sarebbero quelli ottenuti saturando la concentrazione di B, oppure a
concentrazione infinita di B. Questi non possono essere misurati direttamente.
La stima più vicina sarebbe la misura ottenuta alla più alta concentrazione di B..
Una proteina allosterica
Una proteina allosterica è una proteina che contiene due o più siti di
legame topologicamente distinti che interagiscono in modo
funzionale l'un con l'altro. Il che significa che ci sono almeno due siti
in due differenti posizioni che sono capaci di legare dei leganti (substrati,
inibitori...). La formazione di un legame di un legante ad un sito altera le
proprietà dell'altro sito.
La maggioranza delle proteine allosteriche sono degli enzimi per il fatto
che sono capaci di catalizzare delle reazioni, però alcune, come
l'emoglobina, sono semplicemente delle proteine di legame o di
trasporto.
La cinetica sigmoidale
Allo stato attuale il grafico iperbolico, della velocità contro la
concentrazione del substrato vale per gli enzimi che seguono la legge di
Michaelis-Menten,. Un simile grafico per un enzima allosterico dà un
tipo di curva differente chiamato sigmoide, o curva ad S.
Cooperatività
Per cooperatività si intende il cambiamento della costante di legame
della proteina nei confronti di piccole molecole a causa di una
precedente formazione di legami di un'altra piccola molecola.
Se la modificazione aumenta la capacità di legame (o affinità) si parla di
cooperatività positiva. Se questa capacità di legame viene diminuita si
parla di cooperatività negativa.
Gli inibitori e attivatori allosterici, a cui ci riferiremo come effettori allosterici,
sono una delle ragioni principali per l'importanza di detti enzimi. L'alterazione
della velocità di catalisi enzimatiche per inibizione o attivazione è la chiave dei
metodi di controllo metabolici. Il grafico seguente mostra il modo in cui gli
effettori cambiano il grafico cinetico di un tipico enzima che mostra una
coopeatività positiva.
Dalle curve è chiaro che tutte tendano al valore di Vmax. Questo vuol dire che
gli effettori hanno operato sulla capacità di legare il substrato e di conseguenza
sulla Km. Questo sistema è detto Sistema K. Alcuni effettori lavorano
cambiando la V max e si parla di Sistemi V.
Risposta bifasica a inibitori competitivi
Oltre all'inibizione allosterica, gli enzimi allosterici possono subire
l'influenza di normali inibitori competitivi come qualsiasi enzima. Gli
inibitori classici competitivi funzionano perchè sono chimicamente simili
al substrato. In un enzima allosterico con cooperatività positiva da
substrato un inibitore competitivo potrebbe essere molto simile al
substrato in struttura da avere le stesse proprietà cooperative del
substrato. Perciò a basse concentrazioni di substrato un inibitore
competitivo aumenta la capacità dell'enzima di legare il substrato e
quindi la sua velocità di reazione. Ad alte concentrazioni l'inibitore
bloccherà il substrato legandosi al solito modo e rallentando di
conseguenza la reazione.
L'inibitore ha perciò un effetto bifasico. A basse concentrazioni sembra
attivare, mentre ad alte concentrazioni disattiva come al solito.
Ipotesi concertata
Questa ipotesi di Monod, Wyman e Changeaux è una spiegazione semplice ed elegante per la
cooperatività positiva da substrato e l'influenza degli effettori allosterici che sono comportamenti
comuni per gli enzimi allosterici. Si basa sull'idea che un enzima allosterico sia costituito da un
certo numero di subunità che possono esistere in due differenti conformazioni. Ci si riferisce alla
conformazione Rilasciata, o stato R, e alla forma Tesa, o stato T. Le subunità di un particolare
enzima interagiscono in modo tale che devono avere tutte la stessa conformazione. In altre parole
l'enzima deve essere costituito o da soli R o da soli T, non sono ammesse miscele delle due. In
soluzione le due forme si interconvertono l'una nell'altra secondo un equilibrio. Dal momento che
non si possono avere miscele delle due forme, sarà un equilibrio molto semplice tra due forme
consistenti di subunità o di solo R o di solo T.
No
Ipotesi sequenziale
L'ipotesi concertata si basava sull'assunzione che una molecola di enzima
potesse contenere un solo tipo di subunità, R o T. L'ipotesi sequenziale
accetta la possibilità che possano trovarsi enzimi misti, contenenti cioè
entrambe le subunità. Ancora si avrebbe un equilibrio di cui le forme
pure R e T rappresentano gli estremi di questo equilibrio.
Inibitori e attivatori
Si può spiegare facilmente l'influenza degli effettori allosterici. Un
attivatore lavorerebbe allo stesso modo del substrato, anche se si
lega ad un sito differente della subunità, mentre un inibitore
avrebbe l'effetto di rendere l'enzima più rigido rendendogli più
difficile sottostare al cambio dell'adattamento indotto da R a T.
Metodo spettrofotometrico
DA=(p-s). Dc x l
DA=(p-s). Dc x l
Dt
Dt
Micromoli di substrato trasformate al minuti per litro di miscuglio di
incubazione nel saggio
Dc = 1
Dt
nxl
x
106 x DA
p-s
Dt
U = 1
L
nxl
x
106
p-s
x
n=1
DA x
Dt
V
v
Concentrazione attività enzimatica
Attività specifica
purificazione (inibitori)
METODO END POINT
Se la conversione del substrato è completa
S
P
A
DA
t
Acido urico + O2 + H2O
 293=12600
Allantoina + H2O + CO2
 293=nullo
Metodo a dosaggio accoppiato
Modello di reazione accoppiata semplice a singolo substrato
S
P
Enzima principale
P1
Enzima indicatore
Modello di reazione accoppiata ausiliaria a singolo substrato
S
Enzima principale
P
P1
Enzima ausiliario
P2
Enzima indicatore
Reazioni a due Substrati
Sequenziali
Ping-pong
Seguire le variazioni spettrofotometriche di un substrato mantenendo la
concentrazione saturante dell’altro
Sampling method (metodo dell’accumulo)
Si procede alla reazione per un tempo t poi si aggiunge
un reattivo che denatura l’enzima e di colorare al tempo stesso sia il
substrato che il prodotto
Metodi cromatografici
Si differenzia dal precedente solo per la misurazione al posto di uno
spettrofotometro viene utilizzato un cromatografo
Metodi radiometrici
In questa maniera si fa in modo di incamerare nel prodotto uno o più
radioisotopi