Diapositiva 1 - Area Biotecnologie

• Le ceramìdi sono una famiglia di molecole
lipidiche. Una ceramide è composto di
sfingosina e acido grasso. Ceramidi si
trovano in alta concentrazione nelle
membrane cellulari. Sono una delle
componenti lipidiche fonte di
sfingomielina: uno dei principali lipidi dello
doppio strato lipidico delle membrane
cellulari,
Le gangliosidosi GM2
• Sono malattie neurodegenerative prodotte da
una diminuita capacità di metabolizzare i
gangliosidi GM2 che, in normali condizioni, sono
idrolizzati dall’isoenzima A della beta-N-acetilesosaminidasi (EC 3.2.1.52). L’enzima spesso
indicato con la sigla Hex è lisosomiale e
partecipa alla degradazione delle glicoproteine,
dei glicolipidi, dei glicosaminoglicani poiché la
sua attività catalitica si esplica sull’idrolisi del
legame beta-glicosidico della Nacetilglucosammina e della N-acetil
galattosammina
esosaminidasi
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LE ESOSAMINIDASI
L’esosaminidasi A esosaminidasi è un enzima lisosomiale che, con il
cofattore GM2 activator protein , catalizza la degradazione
, del ganglioside GM2 e di altre molecole che hanno Nacetil esosamine terminali. La esosaminidasi A è costituita
da due subunit subunità, alfa e beta, codificate da geni distinti
, HEX-A ed HEX-B). Le subunità alfa e beta sono membri
della famiglia delle glicosil idrolasi. Mutazioni nei geni
della subunit subunità alfa o beta determinano un accumulo di
ganglioside GM2 nei neuroni e di conseguenza alterazioni
neurodegenerative (le gangliosidosi GM2). Mutazioni a
carico del gene per la subunità alfa determinano la
malattia di Tay-Sachs (GM2-gangliosidosi di tipo I).
L’esosaminidasi B esosaminidasi è un omodimero di subunità beta.
L’enzima esosaminidasi (Hex)
• Hex ha una struttura dimerica composta
da due catene non identiche (α e β). Il
grado di omologia è di circa il 60%. Esiste
in due isoenzimi principali: HexA che è un
eterodimero αβ e HexB che è un
omodimero ββ. Esiste anche un terzo
isoenzima poco stabile αα, che raggiunge
livelli del 5% solo quando la subunità β
non viene sintetizzata come succede nella
malattia di Sandhoff.
L’enzima esosaminidasi (Hex)
• Il sito attivo della subunità α idrolizza
preferibilmente substrati provvisti di carica
negativa come il GM2 anche se può
idrolizzare anche substrati neutri. Al
contrario l’attività catalitica della subunità β
si esplica solo su substrati neutri, cioè
l’Hex B non agisce sui gangliosidi GM2.
L’enzima esosaminidasi (Hex)
Come per molti altri enzimi lisosomiali la relativa
semplicità della reazione catalizzata dall’ HEX
contrasta con il complesso processo di
traslocazione del suo precursore ad alto peso
molecolare dal reticolo endoplasmatico ai
ribosomi dove viene immagazzinato nella sua
forma a più basso peso molecolare. Queste
trasformazioni delle catene polipeptidiche non
sono prerequisiti per la piena attività catalitica
che, infatti, è posseduta anche dei precursori,
ma le subunità DEVONO dimerizzare per poter
possedere l’attività catalitica.
L’enzima esosaminidasi (Hex)
• La dimerizzazione delle catene è un prerequisito
per l’attività enzimatica. La dimerizzazione ββ è
più veloce di quella αβ. Così può sucecdere che
all’interno dei lisosomi si trovino catene α non
assemblate.
• Le catene assemblate vengono trasferite nel
Golgi dove vengono aggiunte di mannosio 6
fosfato che è un marker di riconoscimento per
maturare la proteina finale.
DEFICIT ENZIMATICO
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Le Gangliosidosi GM2 sono disordini lisosomiali che si trasemttono in modo
autosomico recessivo e sono caratterizzate dalla incapacità di idrolizzare il
ganglioside GM2 che viene accumulato in particolare nelle cellule neuronali.
La deficienza di HexA (αβ) e di HexB(ββ) prodotta da differenti mutazioni sul
gene che codifica per le subunità β causa la gangliosidosi di tipo 0 detta
anche malattia di Sandhoff). Una deficienza di HexA prodotta da mutazioni
sul gene che codifica per la subunità α, causa la malattia di Tay-Sachs che
coinvolge due tipi enzimologici diversi:
La variante B caratterizzata dalla perdita dell’HexA
La variante B1caratterizzata dall’incapacità di HexA di idrolizzare substrati
negativi ma di poter agire su quelli neutri.
In realtà l’attività enzimatica ha bisogno di un attivatore proteico (GM2
activator protein) la cui mutazione provoca gangliosidosi GM2 che però è
molto più difficile da diagnosticare
FENOTIPI CLINICI
• Il fenotipo clinico delle gangliosidosi GM2
varia considerevolmente da una forma
infantile fino a quella adulta.
• In generale tutte le gangliosidosi hanno gli
stessi sintomi: alterazione del linguaggio,
distonia, convulsioni, eccetera.
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*606869*606869HEXOSAMINIDASE A; HEXAHEXOSAMINIDASE
HEXAGene map locus Gene 15q2315q23--q24q24
IL GENE IL Il gene HEXA codifica la subunità αdelldell’’esosaminidasi A (EC
3.2.1.52EC 3.2.1.52), un enzima, lisosomiale coinvolto nella degradazione
dei gangliosidi.
LA MALATTIA La malattia di Tay--Sachs è un’alterazione
neurodegenerativa progressiva autosomica recessiva che, nella forma
infantile classica, è letale entro il 2°o 3°anno d’età . E’caratterizzata dalla
comparsa, nella prima infanzia, di un ritardo nello sviluppo mentale, seguito
da paralisi, demenza e cecità, e dalla morte prematura. Un segno
caratteristico all’’esame del fondo dell’occhio è la presenza di unla un’area
bianco--grigiastra attorno alla fovea centrale, causata da cellule gangliari
cariche di lipidi, con una macchia rosso ciliegia”. La verifica isto--patologica
conferma la presenza di neuroni di forma tipicamente arrotondati al livello
del sistema nervoso a centrale. E’presente molto precocemente un’
esagerata risposta ai rumori ('startle reaction') che permette di riconoscere
la malattia.
TAYTAY--SACHS DISEASE
• LA MALATTIA di Sandhoff La è un’alterazione neurodegenerativa
progressiva caratterizzata dall’accumulo di gangliosidi GM2,
particolarmente nei neuroni. Il quadro clinico e patologico è molto
simile a quello della malattia di Tay--Sachs Estrema debolezza ne.
primi 6 mesi di vita. Startle reaction, cecità precoce, progressivo
deterioramento mentale e fisico, macchie rosso ciliegia e
macrocefalia,
• HEXBHEXOSAMINIDASE HEXBGene map locus Gene 5q135q13
• IL GENE IL Il gene HEXB codifica la subunità β dell’esosaminidasi A
(EC 3.2.1.52EC 3.2.1.52), un enzima ), lisosomiale coinvolto nella
degradazione dei gangliosidi..
• SANDHOFF DISEASEDISEASE
Caratterizzazione biochimica
• L’Hexb è termostabile l’Hex A no
• Quindi si può determinare prima l’attività
enzimatica totale, poi si inattiva al calore e
si rimisura l’attività con un substrato
fluorogenico:4-Methylumbelliferyl-Nacetyl-β-D-glucosaminide
Caratterizzazione biochimica
• A volte il dosaggio su-descritto può dare una
sovrastima dell’HexA e il dosaggio
immunologico non è adatto perché da un punto
di vista immunologico l’enzima inattivo è
indistinguibile da quello attivo
• La diagnosi della forma B1 si a con un substrato
fluorigenico negativo methyl lumbelliferyl
glucosaminidine 6 sulphate che comunque è
molto costoso specie per poter fare indagini su
popolazioni per rilevare l’eterozigosi
Struttura cristallografica
• E’ stata determinata la struttura
cristallografica dell’HexB ricombinante in
cellule di insetto.
Figura a: i cerchi sono le alfa eliche, i triangoli i beta foglietti, i numeri sono le
posizioni nella sequenza, gli esagoni i siti di glicosilazione e in rosso i ponti
disolfuro. I cerchietti gialli sono i residui del sito attivo.
Sito catalitico: Glu355
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L’interfaccia del dimero
• E’ composta da le regioni C terminali
dell’αβ barrell. I loops sono determinati
dall’elica D E e F. Sono presenti 5 tirosine
e legami polari tra leucine (453 e 546) e
prolina (545)
mutazioni
• C185T ch porta alla sostituzione della
Ser62 in Leu: si è ritrovata nella malattia di
Sandhoff infantile
• La Serina è un residuo che favorisce la
formazione di un beta-turn all’Nterminale
del beta-strand a.
• La leucina lo sfavorisce
• La serina è importante per il fold della
proteina
mutazioni
• C1214T nell’esone 11 porta alla
produzione di un mRNA instabile e con
uno splicing errato cosicchè i livelli di
HexB risultano molto diminuiti
• Pro417Leu e Cys309Tyr sono state
osservate assieme in alcune pazienti. La
cisteina fa i ponti disolfuro che stabilizzano
la struttura
mutazioni
• Arg505Gln è alla base della forma adulta
• L’enzima mutato è instabile al calore
• L’Arg 505 è localizzata all’N terminale
dell’elicaQ e forma un labile legame
idrogeno con la Leu451 (ossigeno
peptidico). La Leu451 ha una vicinanza
diretta con la Tyr450 e l’Asp452 che
giocano un ruolo importante nel legame
col substrato.
TAY-SACHS
TAY-SACHS
TAY-SACHS
• Studi recenti hanno dimostrato una certa
eterogeneità all’interno delle deficienze della
HexA con diversi tipi di mutazione.
• Oltre a quella descritt prima in popolazioni
Francesi-canadesi si ha una prevalenza della
delezione del primo esone o delle sequenze
vicine così da produrre l’assenza dell’mRNA
corrispondente alla subunità α e quindi la
malattia di Tay-Sachs infantile.
TAY-SACHS
• Altre mutazioni non associate con
popolazioni sono: la sostituzione della
lisina482 con l’acido glutammico e la
delezione della citosina in posizione 504
con il risultato di una prematura
terminazione. In ambedue i casi la
proteina risulta difettosa per il suo
trasporto intracellulare dal reticolo
endoplasmatico al Golgi. E queste sono
varianti B
TAY-SACHS
• Tra le varianti B1 si ricorda la sostituzione
dell’istidina 168 con l’arginina che abolisce
l’attività catalitica nei confronti dei GM2
Effective gene therapy in an authentic
model of Tay-Sachs-related diseases
• Mice lacking Hex A and B activity as a result of targeted
disruption of the hex β subunit gene (Sandhoff strain)
provide an authentic model of acute human Tay-Sachs
disease and are invaluable for evaluation of innovative
therapies.
• Indistinguishable from wild-type and heterozygous
littermates at birth, homozygous hexb −/− mice grow
normally to early adulthood. Neurological impairment is
apparent at 3 months with head tremor, followed by
ataxia, bradykinesia, impaired power, and balance. By
4.5 months, hind-limb movement is lost; Sandhoff mice
die before the age of 5 months
Effective gene therapy in an authentic
model of Tay-Sachs-related diseases
• The molecular pathogenesis of brain injury associated
with GM2 storage in humans and animals is ill
understood. Disruption of intracellular structures by the
expanded lysosomal compartment, enhanced excitatory
neurotransmitter activity with abnormal neurite
outgrowth, and the accumulation of cytotoxic metabolites
may all contribute. Impaired generation of
isoglobotrihexosylceramide in Sandhoff mice causes
depletion of natural killer T (NKT) cells, a distinct lineage
of T cells, indicating that presentation of lysosomal
ligands is defective, thereby altering NKT cell responses
to infection, malignancy, and immune recognition.
Effective gene therapy in an authentic
model of Tay-Sachs-related diseases
• With widespread inflammation and storage of GM2 and
other gangliosides, the Tay-Sachs-related diseases
present formidable challenges for treatment. Although
allogeneic bone marrow transplantation has little benefit
in human GM2 gangliosidosis, it partially repopulates the
nervous system with healthy donor macrophages and
ameliorates disease in the Sandhoff mouse . The use of
inhibitors of glycosphingolipid synthesis to balance
formation with the impaired catabolism also delays the
onset of neurological signs in Sandhoff mice. However,
in the absence of appreciable hexosaminidase activity in
this knockout strain or in the acute human GM2
gangliosidoses, monotherapy with substrate-reducing
agents will not arrest the disease.
Effective gene therapy in an authentic
model of Tay-Sachs-related diseases
• M. Begoña Cachón-González et al report the use of
gene therapy delivered directly to the brain for murine
GM2 gangliosidosis. Adult Sandhoff mice were
stereotaxically inoculated with recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors encoding complementing
human β-hexosaminidase α and β subunits (rAAVα and
rAAVβ). Widespread and sustained expression of
hexosaminidase activity in the brain and spinal cord
reduced pathological storage and inflammation. When
onset of neurological signs was delayed markedly and
the pattern of disability was attenuated, survival was
greatly prolonged.