Diapositiva 1

Analisi di laboratorio
per le malattie
autoimmuni
sistemiche
[email protected]
AUTOIMMUNITA’
Disordine del sistema immunitario che non
riconosce più le proprie strutture cellulari e
tissutali e produce anticorpi diretti contro di esse.
L’attivazione persistente delle vie effettrici del
sistema immunitario innesca una reazione autoaggressiva
che può essere di tipo umorale e/o cellulare in grado di
alterare l’integrità e la funzione delle cellule e degli
organi bersaglio.
MALATTIA AUTOIMMUNE
Una malattia autoimmune deve soddisfare i seguenti
criteri:
-evidenza
di
autoantigeni;
una
reazione
immunitaria
verso
-riproducibilità nell'animale da esperimento mediante
inoculazione dell'antigene specifico (le lesioni sono
analoghe a quelle presenti nella patologia umana);
- trasferibilità nell'animale da esperimento mediante
iniezione di siero contenente autoanticorpi o di cellule
autoreattive.
CARATTERI COMUNI A TUTTE LE MALATTIE
AUTOIMMUNI

familiarità

maggior frequenza nel sesso femminile

insorgenza apparentemente spontanea

presenza di ipergammaglobulinemia

decorso cronico, caratterizzato da esacerbazioni e
remissioni
E' anche possibile che manifestazioni cliniche di una
forma si associno a manifestazioni di un'altra malattia
autoimmune (sindromi da sovrapposizione).
Malattie autoimmuni

Malfunzionamento del sistema immunitario

Stato infiammatorio cronico del tessuto colpito

Le malattie autoimmuni sono divise in:
– Connettiviti, non organo specifiche
– Malattie organo specifiche
– Malattie di tipo misto

Incidenza in crescita
– Miglioramento capacità diagnostiche
– Aumentata sensibilità al problema
MALATTIE AUTOIMMUNI
Sistemiche (MAS):







Lupus Eritematoso Sistemico
(LES)
Scleroderma
Dermatomiosite, Polimiosite
Malattia Mista del Tessuto
Connettivo (MCTD)
Sindrome di Sjögren
Granulomatosi di Wegener
Sindrome Antifosfolipidi (APS)
Organo-specifiche:
 Tiroidite autoimmune
 Diabete mellito
 Epatite autoimmune
PRINCIPALI AUTOANTIGENI

A) ANTIGENI PROPRI DELLA MEMBRANA
CELLULARE
- Recettori di superficie - Antigeni vari
AI organo-specifica o sistemica

B) ANTIGENI INTRACITOPLASMATICI LIBERATI
IN
CIRCOLO IN SEGUITO A CITOLISI
- Nucleari, microsomici, mitocondriali, etc.
AI prevalentemente sistemica

C) ANTIGENI INTRACITOPLASMATICI
ESPRESSI IN
SUPERFICIE
(Fenomeno comune a tutte le cellule endocrine)
- C. Tiroidee, Insulari pancreatiche, surrenali
AI prevalentemente organo-specifica
AUTO-ANTICORPI
 NON DIVERSI DAGLI ANTICORPI "NATURALI"
O INDOTTI DA ANTIGENI ESOGENI, SE NON
PER LA REATTIVITA' VERSO AUTOANTIGENI
DIAGNOSTICA DI LABORATORIO
DELLE MAS
 INDICI IMMUNOLOGICI
 INDICI DI FLOGOSI
 INDICI DI LESIONE CITO-TISSUTALE
Indici di flogosi
1.
2.
3.
VES
PCR
Sideremia ed Emoglobina : ridotte
proporzionalmente alla estensione della
flogosi per iperattività del sistema
reticoloendoteliale e per alterazione del
metabolismo del ferro.
INDICI IMMUNOLOGICI
 AUTOANTICORPI CIRCOLANTI
 ATTIVAZIONE
IMMUNITARIO
DEL
 PREDISPOSIZIONE
SISTEMA
GENETICA
DIAGNOSTICA DI LABORATORIO
DELLE MAS: AUTOANTICORPI
CIRCOLANTI
 NON INDICA L’ANDAMENTO DELLA MALATTIA
 RICHIEDE ESPERIENZA (IN PARTICOLARE PER
L’INTERPRETAZIONE DEI QUADRI DI
FLUORESCENZA AL MICROSCOPIO )
 PREZIOSA PER LA DIAGNOSI CLINICA
 DA CORRELARE SEMPRE AL QUADRO CLINICO
AUTOANTICORPI









ANA
ANTI - ds - DNA
ANTI - ENA
ACLA
LAC
ANTI - ss - DNA
ANTI - ISTONI
ANCA
FR CLASSICO
CIRCOLANTI
 CRIOGLOBULINEMIA MISTA
IgM - IgG
 ANTI - EMAZIE
 ANTI – PIASTRINE
 ( ANTI - CITRULLINA )
( ANTI - ALFA FODRINA )
( ANTI - NUCLEOSOMI )
( ALTRI )
CLASSIFICAZIONE DIDATTICA
ANA



Antigeni nucleari estraibili :Sm, U1RNP,
Ro(SSA), La (SSB), Jo1 (istidil tRNA
sintasi), SCL70 (topoisomerasi)
Antigeni nucleari non estraibili :DNAss,
DNAds o DNAn, istoni, centromero
Antigeni citoplasmatici :Jo-1,
mitocondri, ribosomi
AUTOANTICORPI CIRCOLANTI
INDAGINI
 ANA
DI
1° LIVELLO
Connettiviti

Tra i vari autoanticorpi si sono considerati
gli ANA - anticorpi antinucleo:la loro
presenza è una caratteristica peculiare
delle malattie autoimmuni non organo
specifiche

Hep-2 sono i substrati più sensibili
pertanto più indicati nella ricerca degli
ANA
INDAGINE DI 1° LIVELLO
ANA
Gli anticorpi antinucleo (ANA) sono anticorpi
diretti contro macromolecole nucleari naturali
native e/o denaturate comunemente presenti
nel siero dei pazienti con malattie autoimmuni
ANA
FREQUENZA DI ASSOCIAZIONE CON
LE MALATTIE AUTIMMUNI
SISTEMICHE






LES
CM
SS
SSJ
P - DM
AR
> 90 %
100 %
80 %
60 %
30 %
30 %
ANA



…PRESENTI ANCHE
IN PERSONE
SANE
A TITOLO BASSO IN CIRCA IL 18 % DELLE
PERSONE SANE DI ETA’ > 65 AA
IN CIRCA
IL 4 % DELLA
POPOLAZIONE
SANA GIOVANE , A TITOLI MEDIO BASSI
ANA



NON
TEST
DI
SCREENING
DA
RICHIEDERE
SOLO
SU INDICAZIONE
CLINICA
( SOSPETTO DI MAS E / O DI
ALTRE
MALATTIE AUTOIMMUNITARIE
COME L’EPATITE AUTOIMMUNE,
L’ARTRITE CRONICA GIOVANILE, ECC. )
Replicazione
DNA
ANTICORPI
ANTINUCLEO: localizzazione
1
DN 2
TrascrizioneADNA
3
RNA
binding
proteins
Splicing 4
1)dsDNA, istoni, centromero (CENPA,CENP-B,CENP-C)
2)DNA topoisomerasi (Scl70)
3)Ro/SSA,La/SSB
4)U1RNP (u1-u6)
5)Jo1 (istidil tRNA sintetasi)
PremRNA
mRN
A
NUCLEO
Trasporto
mRNA
Traduzione
5
mRNA
Proteine
La ricerca degli AUTOANTICORPI
CITOPLASMA
immunofluorescenza indiretta
immunoenzimatica in fase solida
immunodiffusione
immunoprecipitazione
immunoblotting
ANTI - ENA - Ab






ANTI - SSA ( 52 KD E 60 KD ) ( RIBONUCLEOPROTEINE )
ANTI - SSB
( RIBONUCLEOPROTEINE )
ANTI - SM
( SMALL NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEINS )
ANTI - U1RNP ( SMALL NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEINS )
ANTI - SCL70
( TOPOISOMERASI I )
ANTI - JO1
( ISTIDIL - tRNA - SINTETASI , IN REALTA’
A
LOCALIZZAZIONE NON ENDONUCLEARE , MA
CITOPLASMATICA)
METODI ANALITICI
Immunofluorescenza indiretta (IFI)
Immunoprecipitazione, Immunodiffusione
Controimmunoelettroforesi
Emagglutinazione
RIA / IRMA
Western Blot
Dot Blot, ImmunoBlot
ELISA
L’IMMUNOFLUORESCENZA (IFI)
L’ immunofluorescenza indiretta (IFI) è il
metodo di riferimento per il dosaggio
degli anticorpi anti-nucleo (ANA):
•
Per la sua alta % di sensibilità e specificità
•
Perche’permette di identificare sia il grado di
positività che il tipo di pattern fluoroscopico
METODO D’IFI
Ag-substrato
Ab nel siero
Immunocomplesso
Antiglobulina umana marcata
NB. Osservazione a microscopio a fluorescenza a x 400
Immunofluorescenza Indiretta


Si presta alla ricerca di auto-anticorpi per individuare la
presenza di malattie autoimmuni.
Vantaggi: 
–
–
–
–
–
–

Sensibilità e specificità di reazione.
Semplicità e rapidità d’esecuzione.
Facile riproducibilità.
Permette di ottimizzare l’iter diagnostico.
Costo contenuto.
Indaga sulla presenza di auto-anticorpi e evidenzia pattern non ancora
descritti.
Limiti: 
–
–
–
–
Tecnica soggettiva.
Solubilità di alcuni antigeni nucleari.
Non consente l’identificazione delle specificità anticorpali.
Necessita di un sistema ottico efficiente.
Interpretazione dei risultati

In ogni vetrino è presente:
– un controllo positivo
– un controllo negativo

Sono riportate due informazioni:
– l’intensità della fluorescenza
– la descrizione del pattern.

La classificazione delle immagini è fatta in base alla
fluorescenza osservata (CDC di Atlanta)
–
–
–
–
–
++++: fluorescenza verde brillante
massima positività
+++: fluorescenza verde mela
alta positività
++: fluorescenza positiva chiaramente distinguibile
+: fluorescenza specifica più bassa
0: negativo
Hep-2: pattern omogeneo
Fluorescenza che interessa in maniera
diffusa ed omogenea tutto il nucleo
Hep-2: pattern periferico
Fluorescenza che interessa
prevalentemente la periferia
del nucleo
Hep-2: punteggiato fine
Piccoli punti fluorescenti uniformi
sparsi nel nucleo
Hep-2: Nucleolare
Fluorescenza omogenea dei nucleoli,
associata ad una colorazione e velata
del resto del nucleo
Punteggiato a grandi granuli > 1:1280 (SmRNP)
Punteggiato a piccoli granuli > 1:1280 (SSA+SSB)
Centromerico 1:1280
Ribosomi
Granulare citoplasmatico 1:1280 (AMA)
Anticorpi Antinucleo (ANA)
IFI su cellule Hep-2
Quadri fluoroscopici
Nucleari
omogeneo (DNA, Istoni)
granulare (RNP, Sm, SSA, SSB)
nucleolare (Scl-70)
centromerico ( CENP A.B.C)
Citoplasmatici
punteggiato (Jo1)
mitocondriale (PiruvatoDH)
ribosomiale (RNP)
citoscheletro(actina,vimentina)
Mitotici
fibre del fuso mitotico (tubulina)
poli del fuso mitotico (NuMa)
centrioli (enolasi)
ANA- IFI su cellule Hep-2
TEST POSITIVO
INDAGINI
DI
2°LIVELLO
AUTOANTICORPI CIRCOLANTI:
INDAGINI
DI
2°LIVELLO
ANA+
Indagini di II° livello
Ab
anti-ENA
Ab anti-dsDNA
Anti-dsDNA
La determinazione degli autoAb anti-dsDNA
è raccomandata in ogni caso in presenza di
sintomi riferibili a LES, ovvero in caso di
positività degli ANA ad un titolo > 1:160
Anti-dsDNA

LES :
60 %
IN
FASE
ATTIVA
25 %
IN
FASE
QUIESCENTE
80 %
NEL
LES
CON NEFROPATIA
Anti-dsDNA
In fase diagnostica, si consiglia per la ricerca
degli autoAb anti-dsDNA il




metodo RIA
metodo IFI su Crithidia luciliae, alla
diluizione iniziale del siero 1:10 ( elevata
specificità )
metodo RIA
metodo ELISA (“purchè i risultati positivi
vengano successivamente confermati con il
metodo IFI”)
IFI-ELISA
IFI - ELISA
*
*
*
*
*
elevata sensibilita’e riproducibilita’
facilita’di esecuzione
difficile standardizzazione
soggettivita’
costo ridotto
*standardizzazione
*automatizzazione
* oggettività
* limitato numero di
antigeni nel coating
Crithidia luciliae
Crithidia luciliae
Un campione è positivo se il
kinetoplasto è più fluorescente
del controllo negativo
(anti ds-Dna detection)
ANA-ELISA
alta processività
 oggettività
 standardizzazione
 quantizzazione delle singole componenti
antigeniche con un ruolo patogenetico
accertato

Antigene
nuclei di cellule HeLa
 antigeni purificati con cromatografia di
affinità da nuclei di cellule HEp-2
 antigeni ricombinanti
 estratti nucleari + antigeni ricombinanti

ELISA-punti critici






Qualità antigene impiegato
Qualità della soluzione di ‘coating’
Polarizzazione del legame alla fase solida
Efficacia dell’operazione di lavaggio
Efficienza del fotometro
Range di normalità – Cut-off
ENA-PROFILE


ELISA, altamente sensibile, quantitativa,
test di screening non sufficiente
Western-blot, qualitativo, rivela epitopi rari,
utile nell’approfondimento diagnostico

Immunoblot

Dot-blot
METODI ANALITICI
Metodi ELISA
• Micropozzetti di
polistirene come
fase solida
• Procedure di
lavaggio più intensi
• Rilevazione del
segnale
(assorbanza)
tramite fotometri
• Misurazioni semiquantitative
Metodi DOT blot
E
• Supporti di cellulosa
come fase solida
• Procedure di
lavaggio più ‘gentili’
• Rilevazione del
segnale (banda di
colorazione) ad
occhio
• Misurazioni
qualitative
Anti-Sm
Pattern fluoroscopico : punteggiato
Associazione clinica : LES
Spec: 99%
Sens: 15-30%
Anti-SSA/Ro e anti-SSB/La
Pattern fluoroscopico : punteggiato fine
Associazione clinica :
• 50-80% Sindrome di Sjogren (sub.52Kda)
• 30-50% LES (sub.60Kda)
• BAV
ANTI-RIBOSOMIALE




Sul tessuto epatico danno una fluorescenza intensa
del citoplasma degli epatociti di tipo grossolanamente
granulare;colorano le cellule dei tubuli renali sia
prossimali che distali.
Specificità 99%
10-20% LES
40-80% NEUROLES
ANTI-MITOCONDRIO(AMA)
Bersaglio: PROTEINE DEL COMPLESSO PIRUVATODEIDROGENASI


Importanti nella diagnosi di cirrosi biliare autoimmune.
Fluorescenza grossolanamente granulare nel citoplasma
perinucleare dei tre tessuti, in particolare nelle sezioni di rene
appare piu’intensa la fluorescenza dei tubuli distali rispetto a
quelli prossimali.
FR
CLASSICO
FR




ASSOCIAZIONE
CLASSICO - MALATTIA
AR
SSJ
CRM
ALTRE
MAS
70 %
80 %
100 %
5 - 30 %
FR
CLASSICO
Considerato un test specifico per l’AR la sua
ricerca non ha validità assoluta specie
in fase precoce per le seguenti
considerazioni :
1.frequentemente negativo nelle AR iniziali
2.soffre di troppo facili false positività in
condizioni non reumatoidi
FR






CLASSICO
PUO’
ESSERE
POSITIVO ANCHE :
MALATTIE INFETTIVE
SARCOIDOSI
MALATTIE
LINFOPROLIFERATIVE
MALATTIE EPATICHE
MALATTIE POLMONARI
10 % DELLE PERSONE DI ETA’
ANNI
> 60
QUINDI:




LA
PRESENZA
DEL
FATTORE
REUMATOIDE CLASSICO
NON
E’
ASSOLUTAMENTE
SINONIMO
DI
AR
IL VALORE
PREDITTIVO
PER
AR
DI UN
FATTORE
REUMATOIDE
POSITIVO
E’
DI APPENA
IL
3 % !
DIAGNOSI
DI
AR
RIMANE
ANCORA
UNA
DIAGNOSI
ESSENZIALMENTE
CLINICA,
IN
QUANTO A TUTT’OGGI NELLA PRATICA CLINICA NON
SI
RICERCA
ALCUN AUTOANTICORPO SENSIBILE
E
SPECIFICO
PER
L’AR
RECENTEMENTE
E’
STATO INDIVIDUATO UN
AUTOANTICORPO
CHE
SEMBRA
ESSERE
ABBASTANZA SENSIBILE E SPECIFICO DELL’A R
DIAGNOSTICA DEL FATTORE REUMATOIDE
2 Metodi
Test immunoenzimatici
(ELISA)
Waaler Rose
(Immunoagglutinazione
su vetrino)