biotecnologie - Liceo Recanati

BIOTECNOLOGIE
Le BIOTECNOLOGIE, quelle più recenti, nate dall’incontro della genetica
con la biologia molecolare, consistono in una serie di tecniche utilizzate per
produrre sostanze specifiche da organismi viventi o da loro derivati.
Il fine è produrre beni utili all’uomo:
 in allevamento e in agricoltura per produrre animali e piante transgeniche;
 applicazione del DNA ricombinante per fini medici, curativi o preventivi
(produzione di farmaci, vaccini, terapia genica);
 diagnostica;
 analisi della funzione dei geni, attraverso la clonazione genica;
 mappatura del genoma (sequenziamento del genoma umano);
 ricerca forense (indicazioni sul colpevole, test paternità);
 tutela ambientale (biorisanamento).
Trasduzione
Il DNA ricombinante
La tecnica del DNA ricombinante è alla base delle moderne
biotecnologie (esperimento Cohen- Boyer1973).
Con il termine DNA ricombinante si indica una molecola di
DNA modificata, in cui sono inseriti frammenti di DNA
provenienti da due o più organismi diversi.
si possono ottenere frammenti di DNA di piccole
dimensioni da modificare e analizzare;
si possono produrre grandi quantità di questi frammenti;
si può conoscere la sequenza di questi frammenti;
si possono produrre proteine in grandi quantità;
Gli enzimi di restrizione per ottenere frammenti di DNA
Quando un batterio viene infettato da un virus (batteriofago), produce
degli enzimi speciali che tagliano il DNA virale, rompendo i legami
fosfodiesterici tra due nucleotidi adiacenti.
Questi Enzimi
speciali sono detti
di restrizione :
tagliano entrambi i
filamenti di DNA in
corrispondenza di
specifiche sequenze
nucleotidiche
palindrome, lunghe
4-8 paia di basi e
dette siti di
restrizione.
Le estremità di taglio possono essere piatte (blunt ends) (o coesive
(sticky ends).
Tali enzimi permettono di
isolare un frammento di
DNA compreso tra due
sequenze di taglio, per
esempio un gene, dal resto
della molecola di DNA, per
inserirlo con l’aiuto
dell’enzima DNA-ligasi in
una molecola di DNA
ricevente. Si creano così
molecole di DNA
ricombinante.
Esempi di enzimi di restrizione
L’elettroforesi su gel
L’elettroforesi su gel (di agarosio o poliacrilammide) permette di separare
frammenti di DNA di dimensioni diverse sfruttando la carica negativa delle
molecole di DNA (gruppi fosfato).
CLONARE FRAMMENTI DI DNA
Per trasferire un frammento di DNA da un organismo all’altro o
per ottenere più copie del frammento d’interesse (CLONAZIONE)
si utilizzano molecole di DNA vettore:
1. Plasmidi vettori;
2. Virus fagi;
3. Agrobacterium tumefaciens
I vettori devono soddisfare alcuni requisiti:
- replicarsi in modo indipendente nella cellula ospite
- dimensioni tali da poter essere manipolati
- presentare marcatori genetici per rilevarne la presenza
(esempio geni per la resistenza agli antibiotici)
-presentare una o più sequenze per il riconoscimento con
enzimi di restrizione
Plasmidi
I batteri contengono plasmidi, piccole molecole di DNA circolare e
a doppio filamento con due o pochi geni, che si duplicano in modo
autonomo (possiedono un’origine di duplicazione) e conferiscono ai
batteri vantaggi selettivi.
Si conoscono plasmidi:
1. degradativi, per metabolizzare sostanze tossiche;
2. col, codificano per le colicine, che uccidono altri batteri;
3. della virulenza, trasformano l’ospite in patogeno;
4. F, consentono lo scambio di materiale genetico;
5. R, contengono geni che conferiscono resistenza a determinati
antibiotici poiché codificano per enzimi che degradano il farmaco o
ne riducono gli effetti, tali geni possono essere trasferiti dal plasmide
R al cromosoma batterico, a virus e a batteri di altre specie compresi
patogeni umani
Uso dei plasmidi
plasmide pSC101
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Curtis et al. Invito alla biologia.blu © Zanichelli editore 2012
I plasmidi che hanno incorporato il gene esogeno possono essere inseriti in cellule batteriche e
duplicarsi insieme ad esse, producendo molte copie del gene clonato. Alcuni plasmidi possono
anche permettere l’espressione del gene e produrre quindi proteine in elevate quantità (Es.:
produzione di insulina, vaccino per il virus dell’epatite B).
I vettori di espressione
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Sadava et al. Biologia.blu © Zanichelli editore, 2012
La produzione dell’insulina
Il primo farmaco ricombinante introdotto in commercio fu l’insulina,
ottenuta nel 1978 e approvata nel 1982.
Prima di allora l’insulina veniva purificata dal pancreas di maiali (o bovini)
con una complessa procedura e con il rischio di essere resa inefficace dal
sistema immunitario del paziente che lo riconosceva come estraneo.
Oggi il gene per l’insulina umana è stato clonato e fatto esprimere in
batteri in modo da ottenere grandi quantità di ormone in forma pura.
Oltre all’insulina è possibile produrre:
l’ormone della crescita e altri ormoni come
le gonadotropine , fattori per la
coagulazione per la cura dell’emofilia,
anticorpi, vaccini.
Il vaccino contro l’epatite B
L’antigene di superficie del virus viene prodotto da un lievito, Saccharomyces cerevisiae, e
purificato ed iniettata.
Precedentemente i
vaccini prodotti potevano essere :
• INATTIVI cioè con virus uccisi trattati con appositi agenti inattivanti (ad
esempio il calore ). L’immunità indotta dai vaccini inattivati non è duratura e
sono pertanto necessari frequenti richiami. Sono inoltre rischiosi poiché
possono contenere virus più resistenti al trattamento inattivante come era
accaduto nelle prime partite del vaccino antipolimelitico ucciso (tipo Salk).
• ATTENUATI cioè con virus mutanti vivi ma con ridotta patogenicità in
modo da stabilire una sintomatologia attenuata ma capace di indurre una
risposta immunitaria simile a quella prodotta dall’infezione naturale (esempio
vaccino antipoliomelitico tipo Sabin). La protezione conferita è di lunga
duratura (anche per tutta la vita) ma con il rischio di una riattivazione del
virus o di un mancato attecchimento nel soggetto vaccinato.
I farmaci biotecnologici usati in medicina
prodotto
uso
Fattore della stimolazione
Stimola produzione di leucociti in
pazienti affetti da cancro o AIDS
eritropoietina
Previene l’anemia in pazienti
sottoposti a dialisi renale e terapia
tumorale
Fattore XIII della coagulazione
Permette la coagulazione in pazienti
emofiliaci
Ormone della crescita
Sostituisce l’ormone naturale in
soggetti con crescita ridotta
Attivatore tissutale del plasminogeno
dissolve i coaguli ematici dopo
infarto del miocardio o ictus
Vaccini epatite B, HSV, influenza,
meningite, pertosse
Prevenzione e trattamento delle
malattie infettive.
Fattore di crescita derivato dalle
piastrine
Stimola guarigione dalle ferite
Anche i virus possono funzionare da vettori poiché penetrano facilmente
nelle cellule batteriche e si moltiplicano velocemente al loro interno.
Ne è un esempio il fago lambda. Il virus possiede una molecola di DNA lineare
che presenta alle estremità due sequenze coesive lunghe 12 nucleotidi,
chiamate regioni COS. Quando il fago infetta il batterio E.coli queste sequenze
si attaccano tra loro ed il DNA assume una forma circolare. Un enzima
prodotto dal virus taglia il DNA virale e quello batterico in specifiche regioni e
permette l’integrazione del DNA virale in quello di E.coli.
Piante transgeniche
Con l’ingegneria genetica
si può modificare il
corredo genetico delle
piante.
Le piante sono prodotte
da cellule nel cui DNA è
stato inserito un gene
esogeno per far acquisire
loro caratteristiche che
non possedevano
originariamente.
Piante transgeniche
• Piante ad elevato contenuto nutrizionale
La vitamina A, importante per il metabolismo e per la crescita cellulare è
presente in alimenti come carote, uova e burro. Il riso invece, cereale alla base
dell’alimentazione asiatica, ne è povero. Di conseguenza in India in Estremo
Oriente la popolazione soffre di carenza di vitamina A e ciò porta a 2 milioni
circa di decessi all’anno, soprattutto nell’età infantile. Per questo alcuni
ricercatori svizzeri nel 200 hanno realizzato un riso transgenico Golden Rise
(dal colore giallo intenso) contenente due geni per la sintesi di vitamina A. I geni
provenivano dal mais e dal batterio Erwinia uredovora.
La coltivazione è iniziata nelle Filippine nel 2008 anche se la sua
commercializzazione è finora bloccata.
All’Università del Winsconsin è stata sviluppata una barbabietola ad alto
contenuto di acido folico, una vitamina la cui carenza provoca una forte
anemia.
La lista dei prodotti frutto del connubio tra scienza e agricoltura è
lunghissima: pomodori arricchiti con betacarotene (centro di ricerche di
Belteville), granturco e broccoletti pieni di vitamine A ed E (Università
dell’Illinois), il caffè geneticamente decaffeinato (Università delle Hawaii)
Molti laboratori, compreso quelli dell’Alfred Hospital
di Melbourne, in Australia, stanno studiando anche
la possibilità di somministrare vaccini attraverso i cibi
come la banana anticolera o l’insalata addizionata
con il vaccino per l’epatite B o il morbillo.
…saranno i primi alimenti da acquistare con ricetta
medica?
• Piante transgeniche resistenti ai parassiti
Sono piante resistenti ai parassiti. Un batterio il Bacillus
thuringensis presente nel suolo, possiede un gene che produce una
proteina tossica per molti insetti parassiti. La proteina si lega alle
cellule intestinali degli insetti e ne compromette la funzione così che
l’insetto non riesce più a nutrirsi e muore. La tossina è specifica per
le larve d’insetto ed è innocua per i vertebrati o per gli insetti
benefici come le api.
Il gene è stato inserito in molte piante di interesse agricolo come
mais, cotone e riso, che sono quindi resistenti a molti parassiti e
sono chiamate piante Bt.
•
Piante (mais, colza e soia) per la resistenza ad erbicidi
Anche in questo caso si tratta di geni di origine batterica che
producono sostanze capaci di inattivare erbicidi (come il glifosfato,
il glufosinato, il bromoxinolo) gli erbicidi usati contro le piante
infestanti non sono molto selettivi e possono danneggiare anche il
raccolto poichè agiscono su processi fisiologici come la fotosintesi o
la sintesi di amminoacidi. Rendere le piante coltivate resistenti le fa
sopravvivere anche a quantità elevate di erbicidi.
Biorisanamento
Si possono utilizzare microrganismi per rimuovere sostanze inquinanti dall’ambiente. Il 24 marzo
1989 la petroliera Exxon Valdez naufragò in prossimità delle coste dell’Alaska, riversando in mare
40000 m3 di petrolio che contaminarono l’area costiera per 1500Km. Siusarono dei fertilizzanti
per aumentare la proliferazione di microrganismi presenti naturalmente nell’ambiente capaci di
degradare molti composti organici inquinanti presenti nel petrolio. L’area venne bonificata in tre
anni.
Sono stati creati batteri geneticamente modificati in grado di rimuovere i metalli pesanti
(mercurio, piombo o cadmio) rilasciati dagli scarichi industriali che spesso contaminano le
falde acquifere e difficili da eliminare. Ai batteri (Escherichia coli) è stato aggiunto un
gene capace di legare il mercurio intrappolandolo all’interno della membrana cellulare. I
batteri possono poi essere immobilizzati su un supporto solido per creare biofiltri.
La PCR: reazione a catena della polimerasi
Nel 1983 Kary Mullis vince il premio Nobel per aver sviluppato la tecnica della PCR.
Le genoteche
di frammenti di DNA
Dopo aver clonato il DNA
ricombinante nelle cellule
transgeniche, queste colture cellulari
diventano degli archivi (genoteche)
di informazioni genetiche.
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Sadava et al. Biologia.blu © Zanichelli editore, 2012
Come trovare il gene che ci interessa fra tutte le colonie?
Per individuare quali colonie contengono il gene di interesse possiamo utilizzare una sonda
a DNA cioè un frammento di pochi nucleotidi complementari ad un tratto del gene
d’interesse.
1. Si stende sulle
colonie un filtro di
nitrocellulosa o di
nylon
2. Le cellule assorbite dal
filtro vengono distrutte
(lisi) e il DNA liberato
sottoposto a denaturazione.
3. Il filtro viene bagnato con
una soluzione contenente
la sonda specifica. La sonda è
marcata con 32P ( i suoi nucleotidi
contengono cioè l’isotopo radioattivo
del P).
Dopo un lavaggio, sul filtro restano
solo le sonde geniche che si sono
appaiate al DNA del
gene cercato (ibridazione ). Si
sovrappone al filtro una pellicola
sensibile ai raggi X.
La pellicola sarà impressionata in
corrispondenza delle aree
in cui si sono concentrate le sonde
geniche marcate con
l’isotopo radioattivo
(autoradiografia ).
Il confronto tra le aree della pellicola
impressionate e la
piastra Petri di origine permette di
localizzare le colonie
contenenti il frammento di DNA
bersaglio
Dolly, animale copertina
5 luglio 1996, in una fattoria della cittadina di Roslin ,vicino ad Edimburgo,
nasce Dolly, il primo mammifero clonato che ha tre madri e nemmeno un
padre.
razza Finn
Dorset
razza
Blackface
razza Finn
Dorset
razza
Blackface
La clonazione riproduttiva
L’ embryo splitting permette di ottenere animali identici suddividendo
un unico embrione, quindi riproducendo quello che avviene durante la
formazione di gemelli identici.
Ricercatori dell’Università dell’Oregon a
Portland hanno suddiviso un embrione di
scimmia (Macacus rhesus) di 8 cellule in 4
parti che hanno impiantato nell’utero di
altrettante scimmie: una sola ha portato a
termine la gravidanza
Il metodo si basa sulla capacità della DNA
pol di copiare un filamento di DNA stampo.
Per il sequenziamento sono necessari:
- Il filamento di DNA stampo (di cui si
vuole conoscere la sequenza);
- primer di innesco per la DNA polimerasi;
- la DNA polimerasi;
- miscela di 4 nucleotidi (dNTP);
- 4 nucleotidi modificati (ddNTP quando
sono incorporati nella catena di DNA
nascente non possono legare un
nucleotide successivo ed interrompono la
duplicazione) sono fluorescenti
Come si fa a sequenziare il DNA?
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Sadava et al. Biologia.blu © Zanichelli editore, 2012
Il Progetto Genoma Umano (o HGP dall’inglese Human Genome Project) è stato uno dei
più grandi progetti di ricerca in campo biologico dell’intero Novecento. È stato
completato ufficialmente nel 2003.
Il progetto ha visto la collaborazione di un ente pubblico statunitense, i National Institutes
of Health (NIH), e di un’azienda privata, la Celera Corporation
L’obiettivo era ottenere la sequenza completa del corredo cromosomico aploide di un
essere umano, oltre 3 miliardi di nucleotidi.
Poiché ogni genoma è unico, il Progetto ha previsto la comparazione di diversi campioni
con un’elaborazione statistica dei dati. L’esame delle sequenze ha rivelato alcuni dati di
estremo interesse. Il più sorprendente è che il nostro genoma contiene dai 28000 ai
30000 geni, contro i circa 100000 che i genetisti ritenevano plausibili in precedenza.
Risulta che la maggior parte del DNA umano è costituito da sequenze che non vengono mai
tradotte in polipeptidi, junk DNA («DNA spazzatura»). I ricercatori stanno iniziando a chiarire la
vera natura di questa componente:
• telomeri e centromeri
• introni, attraverso il meccanismo di splicing e in particolare attraverso lo splicing alternativo,
garantiscono al DNA eucariotico versatilità
• sequenze coinvolte nella regolazione dell’espressione genica
• pseudogeni, antichi geni che hanno perso funzionalità in seguito a mutazioni. Molti biologi
ritengono che la loro presenza possa favorire, per mutazione, la comparsa di nuovi geni in
una specie. Vi sono inoltre rari casi di pseudogeni che hanno riacquistato la funzione
perduta attraverso una successiva mutazione.
• trasposoni, elementi in grado di moltiplicarsi e spostarsi nel DNA all’interno del cromosoma
o da un cromosoma ad un altro . A tutt’oggi nessuna funzione utile è stata scoperta per
questi elementi, che, anzi, possono essere coinvolti nell’insorgenza di tumori.
• sequenze ripetute, alcuni studiosi ritengono che tali sequenze siano importanti per dare
compattezza al DNA, e recenti ricerche hanno anche fatto emergere un loro ruolo nel
processo di regolazione della trascrizione.
Applicazioni
• La creazione di una banca dati con lo scopo di identificare ogni
persona attraverso il proprio genotipo per agevolare le indagini
della polizia
• Effettuare screening del DNA per studiare geni anomali
• Esecuzione di screening prenatali per correggere malattie
genetiche fin dai primi mesi di vita
• Creare farmaci compatibili con il DNA dl paziente per evitare
allergie
• Diagnosi prenatale nella fecondazione assistita
• Conoscenza e cura delle malattie
La terapia genica
Il vettore virale infetta le
cellule ed inserisce al loro
interno la copia del gene sano
Lo scopo della terapia genica è
correggere i difetti del genoma che
sono alla base delle malattie
genetiche:
• Il silenziamento dei geni in
tessuti malati (offre la
possibilità di applicazione
contro tumori o contro malattie
degenerative);
• cellule malate potrebbero
essere prelevate modificate
geneticamente ed essere
reimpiantate (esempio SCID
Severe Combined Immuno
Deficiencies), anche le cellule
embrionali potrebbero essere
modificate geneticamente e
reimpiantate.
ADA- SCID sindrome da immunodeficienza combinata grave
Rara malattia genetica causata dalla produzione dell’enzima adenosina deaminasi difettoso
che il sistema immunitario è gravemente compromesso, al punto che l’organismo è incapace
di difendersi dagli agenti infettivi, persino da infezioni comuni come il raffreddore o la
varicella. In passato questi bambini erano costretti a vivere isolati e in ambienti con aria
filtrata per sopravvivere (da qui la definizione di "bambini bolla"). L'unico trattamento
curativo era il trapianto di midollo osseo, effettuabile in presenza di un donatore
compatibile. In alternativa, si può fornire al bambino l'enzima ADA purificato, di origine
bovina , somministrato con iniezioni intramuscolari periodiche: non sempre, però, questa
terapia è efficace o disponibile.
Nel 1990 negli Stati Uniti una bimba di 4 anni è
stata sottoposta con successo alla terapia genica. Il
protocollo terapeutico prevede il prelievo delle
cellule staminali dal midollo osseo dei pazienti, la
loro correzione in laboratorio tramite l'introduzione
del vettore contenente il gene terapeutico e infine la
reinfusione tramite un vettore virale nell'organismo
del paziente. Oggi il protocollo è disponibile anche
in Italia e probabilmente la terapia genica per
l'ADA-SCID potrà diventare un farmaco a tutti gli
effetti ed essere così fruibile da pazienti di tutto il
mondo.
sequenziamento