I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica


La barriera genetica nei confronti della
farmacoresistenza
 Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni
sulla fitness

Misurazione della barriera genetica
 In vitro, in silico, in vivo
 Il ranking delle barriere dei singoli farmaci

Fattori che alterano la barriera genetica
 Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi

La barriera del singolo farmaco e la barriera della
combinazione

La barriera genetica nei confronti della
farmacoresistenza
 Numero e tipo di mutazioni, impatto delle
mutazioni sulla fitness

Misurazione della barriera genetica
 In vitro, in silico, in vivo
 Il ranking delle barriere dei singoli farmaci

Fattori che alterano la barriera genetica
 Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi

La barriera del singolo farmaco e la barriera della
combinazione
ESITO DELLA
PRESSIONE
SELETTIVA
VARIBILITA'
NATURALE
Devono essere
selezionate una o più
mutazioni perché il
virus non sia bloccato
dal farmaco
(fenotipo resistente)

La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché
il virus acquisisca resistenza
 Numero di mutazioni necessarie
 Tipo di mutazioni
 Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione
del virus (fitness)
Devono essere
selezionate una o più
mutazioni perché il
virus non sia bloccato
dal farmaco
(fenotipo resistente)

La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché
il virus acquisisca resistenza
 Numero di mutazioni necessarie
 Tipo di mutazioni
 Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione
del virus (fitness)
Virus resistente,
terapia non più
efficace




Bassa barriera
genetica

Barriera genetica
intermedia
Virus sensibile,
terapia efficace

Elevata barriera
genetica
Devono essere
selezionate una o più
mutazioni perché il
virus non sia bloccato
dal farmaco
(fenotipo resistente)

La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché
il virus acquisisca resistenza
 Numero di mutazioni necessarie
 Tipo di mutazioni
 Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di replicazione
del virus (fitness)
A
C
G
T,U
Purine
Pirimidine
Le transizioni sono evolutivamente favorite rispetto
alle trasversioni
Virus
Rapporto transizione : trasversione
HIV
1.5:1
HCV
50:1
trasversione
transizione

Il sistema cellulare APOBEC3 induce
mutazioni G → A in HIV come meccanismo di
difesa (genetic meltdown)
 HIV ostacola questo meccanismo bloccando
APOBEC3 mediante la propria proteina
“accessoria” Vif

Le transizioni G → A sono quindi favorite
Kulkarni, IHDRW 2011
Kulkarni, JAIDS 2012
Devono essere
selezionate una o più
mutazioni perché il
virus non sia bloccato
dal farmaco
(fenotipo resistente)

La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché
il virus acquisisca resistenza
 Numero di mutazioni necessarie
 Tipo di mutazioni
 Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di
replicazione del virus (fitness)

La fitness di una variante è definita
dalla sua capacità di contribuire
alla successiva generazione

La fitness è sempre funzione delle
condizioni in cui la variante virale
si moltiplica (es. variabili correlate
ai farmaci e alla risposta
immunitaria)

Le diverse varianti competono fra
di loro con esiti dipendenti dalle
condizioni esterne

La fitness di un
mutante può
essere misurata
in vari tipi di
sistemi viruscellula in vitro

Non c’è un gold
standard di
metodo
riconosciuto
http://bis.urmc.rochester.edu:8080/HIVViralFitness/
Virus wild
type
Pressione
farmacologica
Sospensione / cambio terapia
T20-resistance
(HR1)
IN
mutations
TAMs
Most minor PI
mutations
Most major PI
mutations
NNRTI
mutations
65R 74V 184V
RT 215
“revertants”
R5 → X4
Tropism switch
Fast
disappearance
Prolonged
persistence

La barriera genetica nei confronti della
farmacoresistenza
 Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni
sulla fitness

Misurazione della barriera genetica
 In vitro, in silico, in vivo
 Il ranking delle barriere dei singoli farmaci

Fattori che alterano la barriera genetica
 Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi

La barriera del singolo farmaco e la barriera della
combinazione
La terapia ha selezionato una
variante virale farmacoresistente

IC50, dose di farmaco che inibisce del 50% la produzione di virus


Valore meno corrispondente alla reale inibizione ma misurazione più accurata (usato spesso)
IC90, dose di farmaco che inibisce del 90% la produzione di virus

Valore più corrispondente alla reale inibizione ma misurazione poco accurata (usato raramente)
TMC114: an increased genetic barrier
to the development of resistance in vitro
450
TMC114 (R41T, K70E)
RTV (G16E, M46I, V82F, I84V)
SQV (G48V, A71V, G73S, I84V, L90M)
NFV (L10F, D30N, R41K, K45I, M46I, V77I,
I84V, N88D)
400
350
300
APV (L10F, V32I, L33F, M46I, I47V, I50V)
LPV (L10F, L23I, M46I, I50V, I54V, L63P, V82A)
TPV (L33V, M46L, V82T)
ATV (L10F, V32I, M46I, I62V, A71V, I84V, N88S)
250
200
150
100
50
0
0
100
300
500
700
900
1100
Time (days)
De Meyer S, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49: 2314-21.
De Meyer S, et al. XV IHDRW, 2006, Poster 19.
100
Control
NVP (1µM)
EFV (1µM)
Virus breakthrough (%)
80
TMC125 (1µM)
TMC125 (0.2µM)
60
40
20
0
0
4
8
11
15
18
Days post-infection
21
24
27
31
TMC125 suppresses the in vitro selection of resistant HIV-1 from wild-type, suggesting an increased genetic
barrier to the development of HIV drug resistance
Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773-82
Starting from wild type HIV (IIIB)
Azijn, AAC 2010
Seki, CROI 2010
DRV/rtv TPV/rtv
Altri PI/rtv
NRTI non XTC / ETV RPV? / DTG?
RTG EVG?
XTC / NVP EFV / T20

Binding affinity of DRV to
HIV-1 protease >100-fold
higher compared with PIs
due to much slower
dissociation

Decrease in binding affinity
of all PIs on MDR protease
mainly caused by increased
dissociation rate

In contrast to other PIs,
decreases in DRV binding
affinity of up to 1000-fold
do not compromise antiviral
activity

Multiple simultaneous
mutations required to make
the virus resistant to DRV (i.
e. increased genetic barrier)
Dierynck, JV 2007
Model HIV evolution under therapy from longitudinal
and cross-sectional sequence data
For any defined genotype, neighbor mutants can be
computed in silico and the contribution of the
expected mutants to resistance can be calculated
Functions weight for probability and expected time
for mutants to occur
Probability to remain susceptible to a drug (below a
defined phenotypic threshold)
GENETIC BARRIER
Il sistema predittivo
bioinformatico della risposta
al trattamento EuResist
(www.euresist.org) si basa su
tre diverse engine, una delle
quali calcola la barriera
genetica
della et
variante
virale
Altmann
al, AVT
2007

La barriera genetica nei confronti della
farmacoresistenza
 Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni
sulla fitness

Misurazione della barriera genetica
 In vitro, in silico, in vivo
 Il ranking delle barriere dei singoli farmaci

Fattori che alterano la barriera genetica
 Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi

La barriera del singolo farmaco e la barriera della
combinazione
Mutation
Subtypes with
increased barrier*
PR I82A
CG
Subtypes with
decreased barrier*
PR I82T
CG
RT V106M
C
RT V108I
G
RT V118I
G
RT Q151M
DF
RT L210W
C F G AG
RT P225H
A
*With respect to subtype B. Example:
subB
86% Q151M:
CAG  ATG (2 transversions)
12% Q151M:
CAA  ATG (1 transition, 2 transversions)
subF
13% Q151M:
CAG  ATG (2 transversions)
83% Q151M:
CAA  ATG (1 transition, 2 transversions)
Based on analysis of 68 A, 1299 B, 209 C, 24 D, 26 F, 86 G, 20 J, 51 AE, 71 AG sequences from drug-naïve individuals
The prevalence of TPV-RAMs* in HIV-1 subtype A/E and subtype B. *K20M, E35G, K43T, I47V,
I54A/M/V, Q58E, T74P, V82L/T, N83D and I84V were not found (Sungkanuparph, JCV 2007).
Y181C
Wild type
K103N
Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773–82
Virus breakthrough (%)
100
80
60
40
20
0
0
3
6
9
12 15 18
21
24
27 30 33
Days post-infection
Control
TMC125 (0.2µM)
TMC125 40nM
TMC125 (1µM)
Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773-82
Reference data on wild
type virus
Azijn, AAC 2010
Nth failure
3rd failure
2nd failure
1st failure

Le mutazioni
selezionate dai
precedenti regimi
terapeutici
abbassano la
barriera
 Resistenza acquisita
Risposta virologica a 24 settimane di regime
terapeutico contenente Darunavir nei trial DUET e
POWER (pazienti pretrattati con altri PI)
 Resistenza trasmessa

Le mutazioni
selezionate dai
precedenti regimi
terapeutici
abbassano la
barriera
 Resistenza acquisita
 Resistenza trasmessa
Kent, Trends Microbiol 2005
KMIGGIGGF (KF9) è un epitopo CTL HLA-B*1501ristretto che comprende diverse mutazioni di resistenza
ai PI (M46I/L, I47A/V, G48V, I50V)

Epitopi B/T possono
includere siti di mutazioni
di resistenza
 A seconda dell’aplotipo HLA
del paziente, queste
mutazioni possono essere
favorite oppure ostacolate
dalla pressione selettiva
immunologica

Possibili alterazioni della
barriera di un farmaco a
livello di individuo
 Ancora un’area di indagine
Mueller, JAIDS 2011

Epitopi B/T possono
includere siti di mutazioni
di resistenza
 A seconda dell’aplotipo HLA
del paziente, queste
mutazioni possono essere
favorite oppure ostacolate
dalla pressione selettiva
immunologica

Possibili alterazioni della
barriera di un farmaco a
livello di individuo
 Ancora un’area di indagine
Gatanaga, AIDS 2010

La barriera genetica nei confronti della
farmacoresistenza
 Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni
sulla fitness

Misurazione della barriera genetica
 In vitro, in silico, in vivo
 Il ranking delle barriere dei singoli farmaci

Fattori che alterano la barriera genetica
 Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi

La barriera del singolo farmaco e la barriera
della combinazione
Resistance to AZT
develops quickly
Resistance to
whole regimen
develops slowly
Combination therapy (e.g. AZT+3TC+IDV)
Initial resistance
(3TC)
Second step
(AZT+3TC)
Third step
(AZT+3TC+IDV)
“Combination” therapy (e.g. AZT+3TC+IDV)
Initial resistance
(3TC)
Second step
(AZT+3TC)
Third step
(AZT+3TC+IDV)
Local ‘dissociation’ of combination therapy: stepwise
accumulation of resistance