la gascromatografia - Dipartimento di Chimica

LA GASCROMATOGRAFIA
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Il gascromatografo
Schema a blocchi di un
gascromatografo
1) Sistema di
alimentazione del carrier
2) Sistema di
alimentazione dei gas per
il rivelatore (bombola)
3) Iniettore
4) Colonna
5) Rivelatore
6) Camera termostatatica
7) Dispositivo per la
programmazione della
temperatura durante
l’analisi
8) Raccolta ed
elaborazione dati
3
4
Caratteristiche della separazione
mediante gascromatografia
•
•
•
In gascromatografia la fase mobile è un gas che
fluisce in una colonna in cui è posta la fase
stazionaria.
I meccanismi di separazione dei componenti la
miscela sono determinati dalla fase stazionaria,
poiché quella mobile funziona solamente da gas
di trasporto (carrier).
Condizione indispensabile per operare un’analisi
gascromatografica su una miscela, è che essa sia
in grado di passare in fase vapore alla
temperatura di lavoro.
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Colonne tubolari (capillari)
Le colonne capillari sono sicuramente le più
diffuse, la loro lunghezza è nell’ordine della
decina di metri, (non mancano tuttavia colonne
che arrivano anche ai 100 metri) il diametro si
riduce a qualche decimo di millimetro.
• Grazie alla loro particolare struttura e
lunghezza, esse consentono una più
efficiente separazione dei componenti della
miscela
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Scelta della fase mobile
Ricordiamo la dipendenza di H da B, Cm e Cs
H = B/u + Cmu + Cs u
B dipende solo da Dm ed è direttamente proporzionale ad esso. Il suo peso è elevato
per valori piccoli di u, ma tende ad essere trascurabile per valori più elevati, vista la
dipendenza da b/u, mentre il contributo di Cm e Cs
diventa preponderante per valori di u più elevati, ma spesso non hanno lo stesso peso
nel determinare C.
Cm= k1 dt2/Dm
Cs =k2 df2/Ds
Se df è grande, Cs pesa molto, e diminuire Dm non migliora l’efficienza specifica, quindi
diminuirlo serve solo ad aumentare B. Viceversa, Se df è piccolo, Cs pesa poco, e
diminuire Dm migliora l’efficienza specifica agli alti valori di u.
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EFFETTO DELLO SPESSORE DELLA FASE
STAZIONARIA SUL VALORE DI H
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EFFETTO DELLA FASE MOBILE 1
Films sottili di fase stazionaria
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EFFETTO DEL GAS VETTORE 2
Films spessi di fase stazionaria
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Effetto della compressibilità del carrier
gas
• Il VR effettivo di un soluto non può essere misurato direttamente dal tR in
quanto il volume della fase mobile varia con la T e la P, mentre la portata
viene misurata all’uscita della colonna, a T ambiente e P atmosferica.
Bisogna quindi calcolare il valore della portata effettiva alle condizioni
della colonna. Il fattore di correzione per la T può essere calcolato dalla
seguente equazione
• Fc = Fa Tc/Ta
•
La pressione lungo la colonna cromatografica varia in modo non lineare.
La pressione media può essere calcolata dalla formula
Pmed = 2/3[(Pi3- P03)/ (Pi2- P02)]
• V0R = p0/pmed VR
• P0/Pmed viene anche indicato con j
• VR corr =j Vr Fc tr
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• Il fatto di poter fare le correzioni non ci deve far
pensare che l’effetto della temperatura e della
pressione possa essere compensato anche
fisicamente all’interno della colonna.
• La pressione continua ad essere variabile lungo
la colonna, ed il volume del gas vettore si
espande lungo la colonna. Ciò vuol dire che
all’0inizio della colonna avremo gas compresso
di piccolo volume e basse u, mentre in uscita u
aumenta in proporzione a ΔP ed avremo u
elevate, quindi non avremo che per un minimo
tratto u ottimale ed in generale bassa efficienza.
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FASI LIQUIDE PER CROMATOGRAFIA
• La fase liquida per CGL deve essere
caratterizzata da
Bassa volatilità
Stabilità termica
Inerzia chimica
Caratteristiche solventi (valori ottimali di k’ e a).
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TIPOLOGIE DI FASI STAZIONARIE :
POLISILOSSANI
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POLISILOSSANI SOSTITUITI
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FASI STAZIONARIE POLARI CON
STRUTTURA POLIETILEN GLICOL
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Una fase stazionaria chirale:
α - Cyclodextrin
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STRUTTURA DI UNA COLONNA
CAPILLARE
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PLOT column (adsorption)
20
21
Dynamic Coating
a 5% w/w of stationary phase in the solvent will produce a film thickness of
about 0.5 mm. However, this is only approximate, as the film thickness is also
determined by the physical properties of the surface, the solvent and the
stationary phase. After the plug has been run into the front of the column
(sufficient to fill about 10% of the column length), pressure is applied to the
front of the column to force the plug through the column at 2-4 mm per second
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Static Coating
After filling, one end of the column is sealed, and the other end is connected to a
high vacuum pump and placed in an oven and the solvent slowly evaporates and
the front retreats leaving a film of solution on the walls. The solvent then
evaporates from this film and the stationary phase remains as a thin coating on the
wall.
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AUMENTO DELLA STABILITA’ TERMICA
•Fasi chimicamente legate
•“Cross linking”
•Carrier gas privo di ossigeno
•Evitare la presenza di acqua nel
campione
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FASE STABILE FINO A 400 °C
SILANO-CARBORANO
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Camera termostatica
• In gascromatografia la
temperatura della colonna
rappresenta un parametro
fondamentale per ottenere
una buona separazione dei
picchi.
• Le colonne vanno quindi
termostatate in apposite
camere entro le quali la
temperatura resti il più
possibile costante. Nel caso
contrario la riproducibilità
dell’analisi viene
sensibilmente alterata.
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Dispositivo per la programmazione
della temperatura durante l’analisi
• Normalmente la temperatura della colonna è
regolata sul valore corrispondente alla media dei
punti di ebollizione dei componenti della
miscela.
• Per miscele complesse con punti di ebollizione
troppo distanti tra di loro la scelta della
temperatura è problematica.
• La funzione “programma”permette di variare la
temperatura d’analisi. La temperatura viene
mantenuta bassa per le sostanze più volatili e poi
innalzata per consentire la risoluzione delle
sostanze altobollenti. Il tempo di riscaldamento e
le diverse temperature vengono trovate per
tentativi.
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EFFETTO DELLA TEMPERATURA
PROGRAMMATA
45°
145°
programma di T
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Pressure control
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The Mass Flow Controller
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INIETTORE
PER COLONNE
IMPACCATE
Il setto di materiale
polimerico si buca con
facilità e il foro si
richiude
dopo
l’estrazione dell’ago.
Il setto va cambiato
dopo un certo numero
di iniezioni.
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Iniettore
split- splitless
aspetto esterno
Le colonne capillari possono
accettare solo una piccola
quantità di sostanza prima di
sovraccaricarsi. Per iniettare la
quantità ottimale si ricorre a
differenti soluzioni.
Iniettori per capillari, tecnica
split
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The Solute Focusing Method sampling
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The Retention Gap Method of Sampling
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tecnica splitless
In questa tecnica la miscela è
contenuta in un solvente con
temperatura di ebollizione almeno
50°C più basso di quello del
componente più volatile. Subito
prima dell’iniezione, la valvola
splitter viene chiusa e il flusso del
carrier si dirige solo nella colonna.
Fino a che lo splitter rimane chiuso
si ha ingresso in colonna
prevalente- mente della miscela
con solo una porzione del solvente
che, più facilmente volatilizzabile,
tende a diffondere in tutto lo
spazio disponibile. Dopo un tempo
prestabilito la valvola si apre ed Il
carrier “pulisce” l’iniettore dal
solvente residuo.
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EFFETTO DEL TEMPO DI CHIUSURA
DELLE VALVOLE NELL’INIETTORE SPLITSPLITLESS
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Iniettori per capillari
on column
La costruzione di siringhe
con aghi di diametro = 0,3
mm consente la costruzione
di iniettori che immettano il
campione direttamente in
colonna.
Gli iniettori On-Column non
presentano la guarnizione di
protezione (sarebbe troppo
difficile bucarla con l’ago)
ma bensì una valvola che si
apre all’istante quando l’ago
sta per toccarla, e si richiude
subito dopo la sua uscita.
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BIODIESEL
Colonna 10 m x 0,32 mm. met sil., Carrier elio. Iniezione on column.
Prog. :50 °, 1 min a 100°, 15°/ min a 370. Rivelatore FID
La glicerina può
dare origine
durante la
combustione a
prodotti tossici
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INIETTORE PTV
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LARGE VOLUME INJECTION
44
LARGE VOLUME INJECTION
45
Per mantenere le prestazioni della
colonna
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Rivelatore
• Il rivelatore (o detector)
è un dispositivo posto
subito dopo il termine
della colonna con la
funzione di indicare la
presenza del
componente all’uscita
della colonna, e di
fornire la misura della
concentrazione di esso
nel gas di trasporto.
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Segnale o risposta: ogni rivelatore traduce in un segnale
elettrico, espresso in mV o mV, la presenza di una
sostanza.
Il segnale elettrico, che può essere proporzionale alla
concentrazione del componente rivelato o alla sua massa,
viene trasformato generalmente in un grafico.
Sensibilità: la minima differenza (concentrazione o
massa) che lo strumento è in grado di evidenziare.
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CARATTERISTICHE DI UN RIVELATORE
• Intervallo di linearità;
range di concentrazioni
compresa tra il limite di
rivelabilità e il limite di
linearità.
• Limite di
rivelabilità;
• è la
concentrazione
minima che dà
una risposta
tre volte il
semirumore di
fondo
•Sensibilità. Spesso varia al
variare della concentrazione e
dipende dall’errore della
misura
• Intervallo di
risposta
dinamico;
intervallo di
concentrazioni
entro il quale il
rivelatore
risponde, anche
se non in
maniera lineare
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Rivelatore a conducibilità termica: si basa sul
principio del ponte di Wheatstone.
4 filamenti: 2 sono circondati da gas
di trasporto che fluisce (corrente di
riferimento), l’altra coppia è
circondata da gas di trasporto che
proviene dalla colonna. Quando il
ponte è in equilibrio non appare
alcun segnale. Una variazione della
conducibilità termica del gas
(dovuta all’eluizione di analiti con il
gas) produce un segnale tra 1 e 2.
Le resistenze si sbilanciano quando passa un gas con diversa
conducibilità termica.
La dispersione di calore varia e varia, di conseguenza, anche la
resistenza e il ponte si sbilancia dando origine al segnale
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Rivelatore a ionizzazione di fiamma, FID
• In questo rivelatore le sostanze
eluite contenute nel gas di
trasporto vengono bruciate in
una microfiamma di idrogeno
e aria che si estende fra due
elettrodi tra i quali è applicata
una differenza di potenziale di
300 V. Per effetto della
combustione si originano ioni
e pertanto tra gli elettrodi si
manifesta un passaggio di
corrente elettrica di intensità
proporzionale alla quantità
delle sostanze bruciate.
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+
MECCANISMO DI RISPOSTA
PARTE RIDUCENTE DELLA FIAMMA: FORMAZIONE DI RADICALI ECCITATI
PARTE OSSIDANTE:
FORMAZIONE DI IONI POSITIVI
CH.* + O.*
CHO+
CHO+ + H2O
CHO + H3O+
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• In presenza del solo carrier la corrente è quasi
nulla, dovuta a impurezze presenti nel gas di
trasporto o, più spesso, a tracce di fase stazionaria
che sono trascinate via.
• Quando nella fiamma bruciano, oltre ad idrogeno,
anche altre sostanze, aumenta notevolmente la
ionizzazione, e di conseguenza anche la corrente.
• Questo rivelatore è poco selettivo perché sensibile
a tutte le sostanze organiche, ha limite di
rivelabilità da 10-9 a 10-12 g, ha linearità di risposta
da 106 a 108 .
• E’ insensibile solo ai gas permanenti, ad H2S, NH3,
SO2, CO2, CO, H2O. Può lavorare fino a
temperature di 400°C e con qualsiasi gas di
trasporto.
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ALDITOL ACETATI
Spesso in gas cromatografia
vengono formati derivati
volatili per aumentare il
numero delle sostanze
analizzabili
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The Nitrogen Phosphorus Detector
55
Electron capture detector (ECD)
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RIVELATORE A CATTURA DI ELETTRONI
DISEGNO ORIGINALE
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VERSIONE MODERNA
SENZA SORGENTE RADIOATTIVA
Bias voltage is
the amount of
voltage that
an electronic
device needs
in order to
power on and
function
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Chlorinated pesticides
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Organophosphorous pesticides
61
62
SPETTROMETRIA DI MASSA
• La spettrometria di massa è una tecnica che studia
la materia attraverso la determinazione
dell’abbondanza relativa e del rapporto
massa/carica (m/z) di ioni in fase gassosa.
• Nello spettro di massa si riporta l’intensità del
segnale vs m/z e il valore dell’intensità è espresso in
unità arbitrarie.
• Lo spettro è normalizzato rispetto al segnale più
intenso detto picco base.
Caratteristiche operative ed efficienza
delle colonne tubulari
Le colonne di diametro più piccolo hanno la maggiore efficienza specifica, ma una
capacità di carico molto bassa.
La portata può essere un fattore limitante per l’uso di alcuni iniettori e rivelatori
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Effetto dello spessore di film liquido
Benefits
• 0.1 to 0.25µm film
May increase resolution
Decreased column
bleed
Increased signal-tonoise
Increased max. temp
• 1 to 5µm film
Sharper peak shape
Reduced interaction
w/tubing
Other charateristics
• Increased interaction
w/tubing
• Decreased analyte
capacity
• Decreased retention
• Decreased elution
temperature
• May decrease
resolution
• Increased column bleed
• Decreased max. temp.
• Increased retention
• May increase
resolution
• Increased elution
temperature
Selection of Capillary Column
• Choose the proper phase for the compounds
being chromatographed
• Select column ID, film thickness, and length
• Set optimum parameters for your analysis
• a. Optimize column flow (mL/min.)
• b. Choose appropriate carrier gas (hydrogen,
helium, or nitrogen)
• c. Optimize oven temperature program
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Instrument Preparation & Column
Installation
• 1. Cool all heated zones.
• 2. Visually inspect indicating oxygen and moisture traps.
Replace saturated traps.
• 3. Examine the inlet and the detector. Clean or replace all
dirty or corroded parts.
• 4. Replace the inlet liner and septum, and the injector seals
(O-rings, inlet seals, ferrules, etc.).
• 5. Mount the column in the oven with a support that protects
it from scratches. Center the column in the oven.
• This ensures uniform heat exposure generating consistent
retention times.
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• 6. Uncoil the ends to make sure the ends are long enough to
reach the injector and detector. Cut 10cm from each end of
the column. To cut a fused silica column, use the smooth edge
of a ceramic scoring wafer.
• 7. While pointing the inlet end of the column downward (to
prevent shards from falling into the column), slide the nut and
appropriate size ferrule onto the inlet end of the column. Cut
an additional 2cm from the end of the column to remove any
material scraped from the ferrule onto the edge of the
column.
• 8. Install the column the appropriate distance in the injector,
as indicated in your instrument manual.
• 9. Set the carrier gas to the flow rate or inlet pressure
recommended for the column or to your method flow
rate/pressure. Confirm presence of column flow by immersing
the column outlet in a vial of solvent.
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• 10. Flush the column at ambient temperature with carrier gas:
at least 5 minutes for a 25-30m column and 10 minutes for a
50-60m column.
• 11. Set the injector temperatures. Do not exceed the column’s
maximum operating temperature (listed on the column tag).
Check inlet for leaks.
• 12. Install the column into the detector as described in the
instrument manual. Set the detector gases and temperatures
to proper settings.
• 13. Check the detection connections for leaks, using a thermal
conductivity leak detector.
• 14. Verify the carrier gas flow is at the rate you intend to use
for your analysis. Set the split vent, septum purge, and any
other applicable gas rates as appropriate.
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• 15. Inject an unretained compound, to verify the column is
installed correctly and to determine the dead volume time for
checking column flow. A symmetric peak indicates the column
is installed correctly. Adjust the carrier gas flow as necessary.
• 16. Condition the column 20°C above the final analysis
temperature of your method. Do not exceed the column’s
maximum operating temperature. For most applications, 1
hour of conditioning is sufficient. For sensitive detectors or
trace analysis, longer conditioning times or conditioning the
column at the maximum T may be beneficial. Extended time
at high temperatures will not adversely affect column
performance as long as precautions are taken to make sure
the carrier gas is clean and is filtered for oxygen and water.
• 17. To check for instrument performance, analyze a column
test mix for a new method, or a known standard to confirm
proper column and system performance.
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Per veri specialisti: comprehensive GC
x GC
• Due colonne connesse in serie di differente
polarità, in due camere termostatiche
separate.
• La prima colonna è lunga e con diametro
normale. La seconda è corta e con diametro
molto stretto in modo di avere ugualmente
elevata efficienza.
• L’ottimizzazione ed il controllo delle condizioni
di analisi sono di fondamentale importanza.
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Columns: 1, 30m, 0.25mm ID, 0.25μm non polar
2, 1m, 0.10mm ID, 0.10μm polar
Sample: fragrance allergens in MTBE
Instrument: LECO Corporation GCxGC/FID with quad-jet, dual-stage
modulator and secondary oven
Inj.: 0.2μL split (split ratio 1:200),
4mm laminar cup splitter
Inj. temp.: 250°C
Carrier gas: helium, corrected constant flow via pressure ramps
Flow rate: 2mL/min.
Oven temp.: c.1: 40°C (hold 1 min.) to 240°C at 4°C/min.
C.2: 45°C (hold 1 min.) to 245°C at 4°C/min.
Modulation: modulator temperature offset: 20°C
second dimension separation time: 3 sec.
hot pulse time: 0.8 sec.
cool time between stages: 0.7 sec.
Det.: FID at 300°C
makeup flow + column flow: 50mL/min.
hydrogen: 40mL/min.
air: 450mL/min.
data collection rate: 200 Hz
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75
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ANALISI QUALITATIVA
Non è certo il campo più adatto
dell’analisi gas-cromatografica.
Il tR’ può dare delle indicazioni
significative ma non probanti.
Le serie omologhe presentano
valori dei tR’ i cui log sono
funzione lineare del numero di
atomi di carbonio che ne
compongono la catena.
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Kovats retention index
Kovats retention index is a concept used in gas chromatography to convert
retention times into system-independent constants. The index is named after the
Hungarian born Swiss chemist, Ervin Kováts who outlined this concept during the
1950s.
The retention indices of a certain compound is its tR normalised to the tR of
adjacently eluting n-alkanes. While retention times vary with the individual
chromatographic system (e.g. with regards to column length, film thickness,
diameter, carrier gas u and P, Vm), the derived retention indices are quite
independent of these parameters and allow comparing values measured by
different analytical laboratories under varying conditions. Tables of retention
indices can help identify components by comparing experimentally found
retention indices with known values.
The method takes advantage of the linear relationship between the values of
log(tr') and the number of carbon atoms in a molecule. The value of Kovats index
is usually represented by I in matematical expressions. Its applicability is
restricted to organic compounds
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For isothermal chromatography, the Kovats index is given by the equation
Where;
I = Kovats retention index,
n = the number of carbon atoms in the smaller n-alkane,
N = the number of carbon atoms in the larger n-alkane,
tr' = the adjusted retention time.
For temperature programmed chromatography, the Kovats index is
given by the equation
79
80
81
82
Schema di una strumentazione GC-MS
MASS SPECTRUM
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ANALISI QUANTITATIVA
• L’analisi quantitativa cromatografica è basata
sulla misura delle aree dei picchi, dalle quali,
dopo opportuna elaborazione, si risale alle
concentrazioni percentuali dei componenti.
• Metodo della calibrazione diretta
Non si può eseguire perché il volume di
campione iniettato è variabile.
• Metodo dello calibrazione con
standard interno
E’ il metodo comunemente seguito.
85
Si riportano in un grafico i valori trovati per i rapporti tra
le aree in funzione del peso o della concentrazione di A.
AA/AI
PA (CA)
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Si procede poi aggiungendo una quantità costante dello
standard interno (QIS) al campione. Dal cromatogramma della
miscela così ottenuta si misura il rapporto AA/AIS e attraverso il
grafico si risale al valore di PX o di AX.
chlorodibenzodioxines
column: Me, 5%
Phe Sil, 30 m x
0.25 mm I.D.,
0.25 μm (low
bleed)
carrier gas:
helium, 37
cm/sec
inj.: 250 °C. injection: 1 μL, splitless (1 min.) oven: 150 °C (1 min.), 5 °C/min. to 325 °C.
Detector MS, SIM acquisition.
87
highly polar phase; biscyanropopyl polysiloxane—not bonded
88
Fatty acid methyl esters
column: Carbowax, 15 m × 0.10 mm I.D., 0.10 μm; carrier gas: hydrogen, 50 cm/sec; inj.: 250
°C; injection: 0.2 μL, 200:1 split; oven: 140 °C, 40 °C/min. to 280 °C; det.: FID, 280 °C. Animal
origin.
89
column: Bonded; poly(dimethyl siloxane), 15 m × 0.10 mm I.D., 0.10 μm carrier gas:
hydrogen, 45 cm/sec; injection: 0.5 μL, 200:1 split; oven: 175 °C, 30 °C/min. to 275 °C det.:
FID. Bacterial origin
90
column: Carbowax, 15 m × 0.10 mm I.D., 0.10 μm; carrier gas: hydrogen, 50 cm/sec;
injection: 0.2 μL, 200:1 split; oven: 140 °C, 40 °C/min. to 280 °C; det.: FID. Marine origin
91
CN-Propyl silicon
92
column: SP-2560, 75 m x 0.18 mm I.D., 0.14 μm
column: CN-sil, 75 m x
0.18 mm I.D., 0.14 μm;
carrier gas: hydrogen, 25
cm/sec; injection: 0.5 μL,
split 100:1; detector FID.
Sep. isomers
93
Apolar stationary phase
94
Polar stationary phase
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Very polar stationary phase
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Triglycerides are
often injected via
on-column
injection. Use
0.53mm
retention gaps
and appropriate
connectors.
97
98
Crossbond®
5%
diphenyl/5%
dimethyl
polysiloxane)
99