Interferon-gamma ELISA

Istruzioni per l’Uso
Interferon-gamma
ELISA
Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa
di Interferone-gamma (IFN-gamma) umana nel siero e plasma umani
e nei supernatanti di colture cellulari.
BE51021
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
[email protected]
www.IBL-International.com
Interferon-gamma ELISA (BE51021)
ITALIANO
INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE
1.
USO PREVISTO
2
2.
SOMMARIO
2
3.
PRINCIPIO DEL TEST
3
4.
REAGENTI FORNITI
4
5.
ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE
4
6.
PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
4
7.
MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI
5
8.
PRECAUZIONI PER L’USO
5
9.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
6
10. PROCEDURA DEL TEST
8
11. CALCOLO DEI RISULTATI
10
12. LIMITI DELLA PROCEDURA
12
13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
12
14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
15
15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI
16
16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST
17
17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
18
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Interferon-gamma ELISA (BE51021)
1.
ITALIANO
Uso Previsto
L’IFN-gamma umana ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento
quantitativo dell’IFN-gamma umana. L’IFN-gamma umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si
usa per procedure terapeutiche.
2.
Sommario
L’IFN gamma, chiamato anche interferone di tipo II, è una proteina omodimerica contenente
approssimativamente da 21 a 24 subunità. Il gene umano dell’IFN-gamma, situato sul cromosoma 12,
contiene tre introni; i quattro esoni codificano per un polipeptide di 166 amminoacidi, 20 dei quali
costituiscono il peptide segnale.
A differenza della sintesi di IFN-alfa e di IFN-beta, che può avere luogo in qualsiasi cellula, la produzione di
IFN-gamma dipende dai linfociti T e dai linfociti NK. Tutti gli induttori dell’IFN-gamma attivano i linfociti T in
modo policlonale (mitogeni o anticorpi) o in modo specifico per l’antigene, limitato al clone.
L’IFN-gamma è prodotto durante le infezioni da parte di linfociti T del fenotipo soppressore/citotossico (CD8)
e da un sottotipo di linfociti T helper, i linfociti Th1. I linfociti Th1 secernono IL-2, IL-3, TNF-beta e IFNgamma, mentre i linfociti Th2 producono principalmente IL-3, IL-4, IL-5 e IL-10 ma non producono o
producono poco IFN-gamma. L’IFN-gamma inibisce preferenzialmente la proliferazione dei linfociti Th2 ma
non dei Th1 indicando che la presenza di TNF-gamma durante una risposta immunitaria determinerà la
proliferazione preferenziale di linfociti Th1.
L’IFN di tipo II o l’IFN-gamma è una linfochina che non mostra alcuna omologia molecolare con l’IFN di tipo I
ma condivide con esso alcune importanti attività biologiche. In modo più specifico, l’IFN-gamma induce uno
stato antivirale ed è antiproliferativo. L’IFN-gamma, inoltre, presenta diverse proprietà correlate
all’immunoregolazione.
(1) L’IFN-gamma è un potente attivatore dei fagociti mononucleati, cioè stimola l’espressione di Mac-1,
aumenta l’endocitosi e la fagocitosi da parte dei monociti e stimola i macrofagi a uccidere le cellule tumorali
rilasciando intermedi reattivi dell'ossigeno e TNF-alfa.
(2) L’IFN-gamma induce o aumenta l’espressione degli antigeni MHC sui macrofagi, i linfociti T e B e alcune
linee cellulari tumorali.
3) L’IFN-gamma promuove la differenziazione dei linfociti T e B. Stimola la proliferazione dei linfociti B
attivati e può agire in sinergia con IL-2 per aumentare la sintesi della catena leggera delle immunoglobuline.
L’IFN-gamma è uno dei fattori naturali di differenziazione dei linfociti B.
(4) Infine, l’IFN-gamma attiva i neutrofili, i linfociti NK e le cellule dell’endotelio vascolare.
Il ruolo dell’IFN-gamma come marcatore di malattie è stato dimostrato in diverse situazioni patologiche.
-
-
-
infezioni: L’IFN-gamma è prodotto durante le infezioni virali.
L’IFN-gamma è uno strumento diagnostico che permette di differenziare le asciti tubercolari da quelle
non tubercolari. I valori di IFN-gamma nel liquido pleurico sono significativamente superiori nei pazienti
affetti da pleurite tubercolare rispetto ai pazienti affetti da pleurite non tubercolare, con una sensibilità e
una specificità del 100 %.
La riduzione dei sintomi clinici di eritema nodoso leproso indotta da terapia (trattamento con talidomide)
è correlata ai livelli di IFN-gamma e TNF-alfa. I pazienti affetti da lebbra tubercoloide mostrano una
maggiore proliferazione dei linfociti e una maggiore produzione di IFN-gamma in risposta alla
stimolazione con Mycobacterium leprae rispetto ai pazienti affetti da lebbra lepromatosa e agli individui
sani.
patologie autoimmuni: Per la progettazione e il monitoraggio dell’immunoterapia in caso di sclerosi
multipla sono importanti misurazioni accurate della produzione cellulare di citochine, ad es. di IFNgamma.
Rigetto di trapianto: l’espressione intratrapianto dell’mRNA dell’IFN-gamma ha luogo nel rigetto di
trapianto acuto attivo che precede il rigetto di trapianto clinico, offrendo uno strumento diagnostico
precoce per il rilevamento del rigetto di trapianto.
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-
ITALIANO
Allergia: la produzione di IFN-gamma da parte di linfociti isolati non è rilevabile in pazienti con allergia al
latte vaccino rispetto agli individui di controllo.
I neonati che sviluppano atopia producono alla nascita quantità significativamente inferiori di IFN-gamma
rispetto ai neonati che non sviluppano atopia.
diabete: Le cellule linfomononucleate del sangue periferico di pazienti affetti da diabete di tipo I
diagnosticato di recente producono quantità significativamente inferiori di IFN-gamma rispetto ai controlli
e ai pazienti affetti da diabete da lungo tempo.
-
3.
Principio del Test
Figura 1
I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di
rivestimento anti-IFN-gamma umana.
Micropozzetto Rivestito
Anticorpo di Rivestimento
Figura 2
L’IFN-gamma umana presente nel campione o nello standard
si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si
aggiunge un anticorpo anti-IFN-gamma umana coniugato di
biotina, che si lega con l’IFN-gamma umana catturata dal
primo anticorpo.
Prima Incubazione
Standard o Campione
Coniugato di Biotina
Figura 3
Seconda Incubazione
Dopo l’incubazione degli anticorpi di anti-IFN-gamma umana
coniugati alla biotina non legati vengono rimossi durante una
fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-HRP che si
lega all’anticorpo anti-IFN-gamma umana coniugato alla
biotina.
Streptavidina-HRP
Figura 4
Dopo l’incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene
rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta
una soluzione di substrato reattiva all’HRP.
Terza Incubazione
Substrato
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ITALIANO
Figura 5
In proporzione alla quantità di IFN-gamma umana presente
nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato.
La reazione viene terminata aggiungendo l’acido e
l’assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva
standard sulla base di 7 diluizioni standard di IFN-gamma
umana e si determina la concentrazione del campione di
IFN-gamma umana.
4.
Substrato post-reazione
Reagenti Forniti
1
busta d´alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonali anti-IFN-gamma
umana
1
flaconcino (70 µL) con Coniugato di Biotina (anticorpi monoclonali anti-IFN-gamma umana)
1
flaconcino (150 µL) con Streptavidina-HRP
2
flaconcini con Standard IFN-gamma umana liofilizzato, 200 ng/mL dopo ricostituzione
1
flaconcino (12 mL) Diluente dei Campioni
Nota Bene: In alcuni, rarissimi, casi, è stato osservato un precipitato insolubile di proteine stabilizzanti nel
flacone del Diluente dei Campioni. Questo precipitato non interferisce in alcun modo nelle prestazioni del
test e può quindi essere ignorato.
1
flaconcino (5 mL) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x
(PBS con 1 %Tween 20, 10 % BSA)
1
flaconcino (50 mL) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x
(PBS con 1 %Tween 20)
1
flaconcino (15 mL) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina)
1
flaconcino (15 mL) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M)
4
Copripiastra adesivi
5.
Istruzioni di Conservazione
Conservare i reagenti del kit a 2-8 °C. Conservare i controlli liofilizzatti a -20 °C.
Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 °C. La scadenza del kit e dei reagenti è
indicata sulle etichette.
La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati
correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la
prima manipolazione.
6.
Prelievo e conservazione dei Campioni
Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA,
citrato, eparina). Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all’uso per questo dosaggio. Dopo la
coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile.
I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio.
Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici.
I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 °C, per evitare la perdita di IFN-gamma
umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una
temperatura tra 2 °C ed 8 °C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5).
Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev’essere
portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela.
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7.
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Materiali necessari ma no forniti
−
Pipette graduate da 5 mL e 10 mL
−
Micropipette adattabili da 5 µL a 1000 µL a canale singolo, con punte usa e getta
−
Micropipette adattabili da 50 µL to 300 µL multicanale con punte usa e getta
−
Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti
−
Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti
−
Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico.
−
Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d’onda di riferimento
620 nm)
−
Acqua bidistillata o deionizzata
−
Calcolatore statistico con programma che esegua l’analisi di regressione
8.
Precauzioni per l’Uso
- Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò,
l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze
alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali.
Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi,
immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli.
- I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico.
- Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza.
- Non usare i kit dopo la data di scadenza.
- Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce.
- Non pipettare utilizzando la bocca.
- Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni.
- Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose.
- Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni.
- Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo.
- Evitare schizzi o produzione di aereosol.
- Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che
invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso.
- Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato.
- L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato.
- Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti.
- La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo.
- Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè
potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per
minimo 1 ora a 121.5 °C.
- Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio
ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti
liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido.
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9.
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Preparazione dei Reagenti
Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a
temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tamponi presenta
cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli.
9.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)
Versare l'intero contenuto (50 mL) del Tampone di Lavaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato
pulito da 1000 mL. Portare il volume finale a 1000 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata.
Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Il pH della soluzione finale deve essere
portato a 7.4.
Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 °C e 25 °C. Il
Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni.
Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente:
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
Soluzione Tampone di Lavaggio
Concentrato (20x) (mL)
25
50
Acqua Distillata (mL)
475
950
9.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)
Versare l'intero contenuto (5 mL) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato
pulito da 100 mL. Portare il volume finale a 100 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata.
Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
Conservare a temperature comprese fra 2 °C e 25 °C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni.
Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente;
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
Soluzione Tampone di Dosaggio
Concentrato (20x) (mL)
2.5
5.0
Acqua Distillata (mL)
47.5
95.0
9.3. Preparazione di Coniugato di Biotina
Il Coniugato di Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione.
La Soluzione Coniugato di Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in
una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente:
Numero di Strisce
1-6
1 - 12
Coniugato di Biotiona (mL)
0.03
0.06
Tampone di Dosaggio (1x) (mL)
2.97
5.94
9.4. Streptavidina-HRP
La Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione.
La Streptavidina-HRP concentrata deve essere diluita 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta
di plastica pulita secondo la tabella seguente:
Numero di Strisce
Streptavidina-HRP (mL)
Tampone di Dosaggio (1x) (mL)
1-6
0.06
5.94
1 - 12
0.12
11.88
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9.5. Standard IFN-gamma Umana
Ricostituire lo Standard IFN-gamma umana aggiunendo acqua distillata.
Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare
gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard
ricostituito = 200 ng/mL). Lasciare lo standard a ricostituire per 10-30 minuti. Prima di fare le diluizione
mescolare bene.
Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato.
Lo standard concentrato di IFN-gamma umano deve essere diluito 1:1000 con il Tampone di Dosaggio
(1x) subito prima dell’uso in una provetta di plastica pulita in base al seguente schema di diluizione:
Diluizione 1: 100 µL di standard concentrato di IFN-gamma umano + 900 µL di Tampone di Dosaggio (1x)
(concentrazione della diluizione 1 = 20 ng/mL).
Diluizione 2: 10 µL di diluizione 1 + 990 µL di Tampone di Dosaggio (1x) (concentrazione della diluizione 2 =
200 pg/mL). Agitare dolcemente per miscelare.
La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi
(vedi 9.5.1).
9.5.1. Diluzione Standard Esterna
Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard.
S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.
Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo:
Pipettare 225 uL di Diluente dei Campioni a tutti tubi.
Pipettare 225 µL di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 200 pg/mL) nel primo tubo,
etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 100 pg/mL).
Pipettare 225 µL di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del
successivo transferimento.
Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 6).
Il Diluente dei Campioni serve come bianco.
Figura 6
Transferire 225 µL
S1
Standard
IFN-gamma Umana
1:1000 diluito
26.11.14 (24)
S2
S3
Diluente dei Campioni
225 µL
S4
-
S7
Buttare
225 µL
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10.
Procedura del Test
a.
Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di
campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono
essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e
conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 °C e
perfettamente sigillate.
b.
Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µL di Tampone di Lavaggio per
pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere
al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa 10-15 secondi prima dell'aspirazione. Evitare
di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con
un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip
subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non
lasciar asciugare i pozzetti.
c.
Diluizione dello standard in micropozetti
(alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi – vedi 9.5.1)
Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare
100 µL standard preparato (vedi 9.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 200 pg/mL) in
duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso
ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = 100.0 pg/mL) e trasferire
100 µL, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 7). Fare attenzione a non graffiare la
parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard
in diluizione con concentrazione da 100.0 a 1.6 pg/mL. Buttare 100 µL del contenuto degli ultimi
pozzetti (G1 e G2).
Figura 7
Transferire 100 µL
S1
Standard
IFN-gamma Umana
1:1000 diluito
26.11.14 (24)
S2
S3
Diluente dei Campioni
100 µL
S4
-
S7
Buttare
100 µL
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ITALIANO
In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1) pipettare 100 µL di queste diluizioni standard
(S1–S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1.
Tavola 1
Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti:
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
Standard 1
(100.0 pg/mL)
Standard 2
(50.0 pg/mL)
Standard 3
(25.0 pg/mL)
Standard 4
(12.5 pg/mL)
Standard 5
(6.3 pg/mL)
Standard 6
(3.1 pg/mL)
Standard 7
(1.6 pg/mL)
Standard 1
(100.0 pg/mL)
Standard 2
(50.0 pg/mL)
Standard 3
(25.0 pg/mL)
Standard 4
(12.5 pg/mL)
Standard 5
(6.3 pg/mL)
Standard 6
(3.1 pg/mL)
Standard 7
(1.6 pg/mL)
Bianco
Bianco
3
4
Campione 1
Campione 1
Campione 2
Campione 2
Campione 3
Campione 3
Campione 4
Campione 4
Campione 5
Campione 5
Campione 6
Campione 6
Campione 7
Campione 7
Campione 8
Campione 8
d.
Dispensare 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco.
e.
Dispensare 50 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni.
f.
Dispensare 50 µL di ogni campione in duplicato ai pozzetti dei campioni.
g.
Preparare il Coniugato di Biotina (vedere la preparazione del Coniugato di Biotina 9.3)
h.
Dispensare 50 µL di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto.
i.
Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 2 ore
utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm.
j.
Preparare la Streptavidina-HRP diluita (vedere la Preparazione di Streptavidina-HRP 9.4).
k.
Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 3 volte come descritto
in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo.
l.
Dispensare 100 µL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, inclusi quelli di bianco.
m.
Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora
utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm.
n
Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 3 volte come descritto
in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo.
o.
Pipettare 100 µL di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti.
26.11.14 (24)
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p.
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Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 °C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione
diretta a luci intense.
È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del
substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di
essere appropriatamente registrabili.
La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni
singolo parametro.
Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un
colore blu scuro.
Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La
reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di
0.9-0.95.
q.
Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µL di Soluzione Stopp in ciascun
pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda
rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I
risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora
se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 °C.
r.
Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come
lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da
610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del
produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli
standard.
Note: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più
bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi.
11.
CALCOLO DEI RISULTATI
-
Calcolare i valori medi dell’assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati
devono rientrare nel 20 % del valore medio.
-
Creare una curva standard segnando l’assorbanza media di ogni concentrazione standard
sull’ordinata contro la concentrazione di IFN-gamma umana sull’ascissa. Disegnare una curva di
best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri).
-
Per determinare la concentrazione di IFN-gamma umana circolante per ogni campione, trovare
prima il valore medio di assorbanza sull’ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva
standard. Nel punto d’intersezione estendere una linea verticale fino all’ascissa e leggere il valore
corrispondente della concentrazione di IFN-gamma umana.
-
Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulai sono
stati diluiti 1:2 (50 µL campione + 50 µL Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla
curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x).
-
Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per
risultato livelli scorretti e bassi di IFN-gamma umana. Questi campioni richiedono un’ulteriore
pre-diluizione esterna secondo i valori stimati dell’ IFN-gamma umana, con un Diluente dei
Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IFN-gamma umana.
-
Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione
di IFN-gamma umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i
valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non
essere validi.
-
La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per
dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di
strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.
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Interferon-gamma ELISA (BE51021)
ITALIANO
Figura 8
Curva standard rappresentativa per l’IFN-gamma umana ELISA. L’IFN-gamma umana è stato diluito in 2
fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva
standard dev’essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.
IFN-γ ELISA
10
OD (450 nm)
1
0.1
0.01
1
10
100
pg/m L
Tavola 2
Dati tipici relativi all’uso dell’IFN-gamma umana ELISA
Lunghezza d’onda: 450 nm
Lunghezza d’onda di riferimento: 620 nm
1
Concentrazione
IFN-gamma
Umana (pg/mL)
100.0
2
50.0
3
25.0
4
12.5
5
6.25
6
3.1
7
1.6
Bianco
0.0
Standard
D.O.
(450 nm)
D.O. Media
(450 nm)
2.210
2.143
1.307
1.376
0.802
0.805
0.450
0.475
0.257
0.250
0.139
0.132
0.085
0.077
0.027
0.027
2.177
C.V.
(%)
1.342
0.804
0.3
0.463
3.8
0.254
2.0
0.136
3.7
0.081
7.0
0.027
0.0
I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad
es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può
influenzare l’attività enzimatica e quindi l’intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi.
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Interferon-gamma ELISA (BE51021)
ITALIANO
12.
LIMITI DELLA PROCEDURA
-
Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva
standard per ogni esecuzione del test.
-
La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione
crociata tra reagenti può casusare risultati erronei.
-
Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro
riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell’uso.
-
Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o
falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca,
riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti
scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati.
-
L’uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi
umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali
murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi
delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le
immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante)
vengono aggiunti al campione.
13.
Caratteristiche di Prestazione
13.1. Sensibilità
Il limite di rilevamento dell’IFN-gamma umana definito come la concentrazione dell’analita, risultante in
un’assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni
standard), è stato determinato di 0.99 pg/mL (media di 6 dosaggi indipendenti).
13.2. Riproducibilità
13.2.1. Intra-Dosaggio
La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è
stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IFN-gamma umana.
Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione
media di IFN-gamma umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente
complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 4.5 %.
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Interferon-gamma ELISA (BE51021)
ITALIANO
Tavola 3
La concentrazione media di IFN-gamma umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione
Campione
Esperimento
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
4
5
6
7
8
Concentrazione media di
IFN-gamma umana
(pg/mL)
173
184
160
216
220
212
101
112
100
290
300
277
18.0
18.5
18.7
27.9
31.1
27.4
75.4
69.5
61.4
9.6
11.0
9.7
Coefficiente di
Variazione (%)
2.5
7.3
2.1
3.0
5.4
1.7
2.0
2.4
0.3
1.6
3.7
0.5
4.9
7.8
6.7
3.1
8.0
6.7
7.7
5.3
4.6
2.9
7.2
10.7
13.2.2. Inter-Dosaggio
La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è
stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IFN-gamma umana.
Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione
media di IFN-gamma umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente
complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 5.7 %.
Tavola 4
La concentrazione media di IFN-gamma umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione:
Campione
1
2
3
4
5
6
7
8
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Concentrazione media di IFNgamma Umana (pg/mL)
172.0
216.0
104.0
289.0
18.4
28.8
68.8
10.1
Coefficiente di
Variazione (%)
7.2
1.8
5.9
3.9
2.0
6.8
10.3
7.8
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Interferon-gamma ELISA (BE51021)
ITALIANO
13.3. Test di Recupero
Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 4 livelli di IFN-gamma umana in un pool di siero umano
normale e campioni di plasma citrato. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti
indipendenti, ognuno con 8 replicati.
In questi esperimenti il siero non addizionati sono stati usati come bianchi.
Il recupero aveva un range dal 88 % al 112 % nei campioni di siero con un recupero medio complessivo del
97 %.
13.4. Parallelismo della Diluizione
4 campioni di siero con diversi livelli di IFN-gamma umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di
2 e con 4 replicati l’uno.
Il recupero rientrava in un range dal 86 % al 114 % con un recupero medio complessivo del 99 % (vedere
Tavola 5)
Tavola 5
Campione
1
2
3
4
Diluizione
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
Concentrazione
Concentrazione
Attesa di IFN-gamma Misurata di IFN-gamma
Umana (pg/mL)
Umana (pg/mL)
144.4
72.2
67.0
36.1
35.6
18.0
15.8
161.7
80.8
81.2
40.4
44.1
20.2
23.0
100.4
50.2
44.9
25.1
23.2
12.5
10.7
261.5
130.8
140.5
65.4
69.4
32.7
32.5
Recupero di
Concentrazione Attesa di
IFN-gamma Umana (%)
93
99
87
101
109
114
90
93
86
108
106
99
13.5. Stabilità dei Campioni
13.5.1. Stabilità a Congelamento - Scongelamento
Aliquote di campioni di siero (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 °C e scongelati 5
volte e sono stati determinati i livelli di IFN-gamma umana. Si è rilevata una perdita significativa di
immunoreattività della IFN-gamma umana (30 %) con altri congelamento e lo scongelamento. Una
riduzione significativa (30 %) dell’immunoreattività dell’IFN-gamma umano è stata rilevata in caso di 2 o più
cicli di congelamento e scongelamento. I campioni devono quindi essere conservati in aliquote a -20 °C e
scongelati solo una volta.
13.5.2. Stabilità della Conservazione
Aliquote di campioni di siero e supernatanti di cultura celulari (addizionati o non addizionati) sono state
conservate a -20 °C, 2-8 °C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 °C e il livello di IFN-gamma umana ne è
stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una
perdita significativa di immunoreattività dello IFN-gamma umana. Si è rilevata una perdita significativa di
immunoreattività della IFN-gamma umana (50 %) durante la conservazione a 37 °C dopo 24 ore.
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Interferon-gamma ELISA (BE51021)
ITALIANO
13.6. Comparazione tra Siero e Plasma
Sono stati valutati siero ed EDTA, citrato e plasma eparinato ottenuti contemporaneamente e di due
individui. Le concentrazioni di IFN-gamma umana non erano significativamente diverse; quindi tutti questi
fluidi corporei sono idonei al dosaggio. Tuttavia, è altamente raccomandato di garantire l’uniformità delle
preparazioni del sangue.
13.7. Specificità
La reattività crociata e l’interferenza di fattori circolanti del sistema immunitario sono state valutate
addizionando queste proteine in concentrazioni fisiologicamente rilevanti ad un siero positivo di IFN-gamma
umana.
Non si è rilevata alcuna reattività crociata o interferenza.
13.8. Valori Attesi
Per la IFN-gamma Umana è stato testato un pannello di 40 campioni di siero ed EDTA, citrato e plasma
eparinato di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). I livelli
elevati di IFN-gamma umano dipendono dal tipo di disturbo immunologico. I livelli misurati possono variare
con la raccolta di campioni usata. Per i livelli di IFN-gamma Umana misurati vedi la Tavola 6.
Tavola 6
Matrice di
Campione
Siero
Plasma (EDTA)
Plasma (Citrato)
Plasma (Heparina)
Numero di Campioni
Esaminati
40
40
40
40
Intervallo
(pg/mL)
nd* - 188.9
nd* - 9.1
nd* - 4.0
nd* - 4.3
% Rilevable
10.0
7.5
2.5
2.5
Media dei Valori
Rilevabile (pg/mL)
55.7
6.0
---
*nd = non-detectable (non rilevabile), i campioni misurati sotto il punto standard più basso sono stati
considerati non rilevabili.
13.9. Calibrazione
Il dosaggio immune è calibrato con IFN-gamma Umana ricombinante altamente purificato che è stato
valutato in base allo standard di riferimento internazionale NIBSC 82/587 ha dimostrato di essere il suo
equivalente. Il NIBSC 82/587 è quantificato in unità internazionali (IU); 1IU corrisponde a 50 pg di IFNgamma Umana.
14.
INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
Per gli ordini contattare:
Vedi ultima pagina.
Per informazioni tecniche contattare:
e-mail: [email protected]
www.IBL-International.com
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15.
ITALIANO
Sommario: Preparazione dei Reagenti
15.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)
Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 mL) a 950 mL di acqua distillata.
Numero
di strisce
1-6
1-12
Soluzione Tampone di Lavaggio
Concentrata (mL)
25
50
Acqua
Distillata (mL)
475
950
15.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)
Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 mL) a 95 mL di acqua distillata.
Numero
di strisce
1-6
1-12
Soluzione Tampone di Dosaggio
Concentrata (mL)
2.5
5.0
Acqua
Distillata (mL)
47.5
95.0
15.3. Coniugato di Biotina
Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x):
Numero
di strisce
1-6
1-12
Coniugato de Biotina
(mL)
0.03
0.06
Soluzione Tampone di
Dosaggio (1x) (mL)
2.97
5.94
15.4. Estreptavidina-HRP
Fare una diluizione 1:100 di Streptavidina-HRP nel Tampone di Dosaggio (1x):
Numero
di strisce
1-6
1-12
Streptavidina-HRP
(mL)
0.06
0.12
Tampone di Dosaggio (1x)
(mL)
5.94
11.88
15.5. Standard IFN-gamma Umana
Reconstituire il Standard liofilizzato di IFN-gamma umana con acqua distillata.
(Il volume di ricostituzione è dichiarato sull’etichetta del flaconcino dello standard.)
Lo standard concentrato di IFN-gamma umana deve essere diluito 1:1000 con il Tampone di Dosaggio
(1x).
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ITALIANO
16.
Sommario di Procedura del Test
1.
Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto.
2.
Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio.
3.
Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni, in
duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µL di standard preparato nei primi pozzetti e
creare diluizioni di standard trasferendo 100 µL da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µL dagli ultimi
pozzetti.
Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.5.1.): Pipettare 100 µL di queste
diluizioni dello standard nei micropozzetti.
4.
Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti del bianco.
5.
Aggiungere 50 µL di Diluente dei Campioni a tutti i pozzetti.
6.
Aggiungere 50 µL di campione in duplicato a tutti i pozzetti.
7.
Preparare il Coniugato di Biotina.
8.
Aggiungere 50 µL di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti.
9.
Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 °C).
10.
Preparare la Streptavidina-HRP.
11.
Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio.
12.
Aggiungere 100 µL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti.
13.
Coprire le strisce e incubare 1 ore a temperatura ambiente (18-25 °C).
14.
Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio.
15.
Aggiungere 100 µL di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti.
16.
Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C).
17.
Aggiungere 100 µL di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti.
18.
Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l’intensità del colore a 450 nm.
Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di supernatanti di
colture cellulari sono stati diluiti 1:2 (50 µL di campione + 50 Diluente di Campioni). La
concentrazione letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x).
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Interferon-gamma ELISA (BE51021)
17.
ITALIANO
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These
cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit.
Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20