TESI Sere - comunicazionericercascientifica

Ruolo di TDP43 nella
Sclerosi Laterale Amiotrofica
Internato di tesi svolto presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche,
Università degli Studi di Milano
Fondazione IRCCS CA’ GRANDA Ospedale Maggiore Policlinico
Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Silvia DE BIASI
Correlatore: Chiar.mo Prof. Giacomo P. COMI
Tesi di Laurea di:
Serena Diana Ghezzi
Sclerosi Laterale Amiotrofica
La
Sclerosi
Laterale
Amiotrofica
(SLA)
è
una
patologia
neurodegenerativa fatale, risultato del preminente interessamento dei
motoneuroni superiori e inferiori. La durata di malattia dal momento
dell’esordio dei sintomi è in media di 3-5 anni con un decorso più
rapido nelle forme ad esordio bulbare.
tipo di SLA
gene
classe
L’exitus avviene generalmente in seguito
a paralisi della muscolatura respiratoria
La diagnosi è essenzialmente clinica,
non esiste infatti un test diagnostico
specifico.
5-10%
90-95%
familiari (SLAf)
sporadici (SLAs)
Dati familiari ed epidemiologici indicano
che i fattori genetici contribuiscono alla
sua patogenesi.
INTRODUZIONE
geni mendeliani
SLA1
SOD1
enzima detossificante
SLA2
ALS2
signali GEF
SLA4
SETX
metabolismo del DNA e dell’ RNA
SLA5
SPG11
SLA6
FUS
SLA8
VAPB
recettore o trasportatore di
membrana
legame al RNA, silenziamento e
riparo del DNA
traffico vesciculare
SLA9
ANG
neovascolarizzazione
SLA10
TARDBP
legame all’RNA ed exon skipping
SLA
DCTN1
trasporto assonale
MAPT
SLAFTDP
loci mendeliani
SLA3
Ignoto
assemblamento dei microtubuli e
loro stabilità
Ignota
SLA7
Ignoto
Ignota
SLA-X
Ignoto
Ignota
SLA-FTD1
Ignoto
Ignota
SLA-FTD2
Ignoto
Ignota
TARDBP
La proteina TAR DNA binding protein (TDP43) è il principale componente
delle inclusioni citoplasmatiche neuronali ubiquitino-positive presenti nella
maggior parte dei casi SLAs e di SLAf negativi per mutazioni di SOD1
Nel tessuto nervoso dei pazienti SLA,
TDP43 è iperfosforilata, ubiquitinata e
clivata in modo anomalo. Si ipotizza che
in condizioni patologiche la proteina sia
eliminata dal nucleo e si accumuli a
livello del citoplasma innescando la
degenerazione motoneuronale
INTRODUZIONE
TARDBP (TDP43)
ex1
ex2
NLS
ex3
RRM1
ex4
ex5
RRM2
ex6
GRR
1p36
414 aa, 43 KDa
segnale di
siti di interazione con
sito di interazione
localizzazione nucleare
l’mRNA
hnRNP
Sito di clivaggio (aa86-89)
Sito di clivaggio (aa216-219)
1. regolazione della trascrizione
2. regolazione dello splicing
3. stabilità dell’mRNA
INTRODUZIONE
OBIETTIVI
Lo scopo del nostro studio è stato quello di caratterizzare
geneticamente l’ampia coorte di pazienti SLA afferenti
all’Ambulatorio Malattie del Motoneurone – Dipartimento
di Scienze Neurologiche – Policlinico di Milano.
Tale studio ci ha permesso di individuare la mutazione
A382T risultata essere la variante più comune sul territorio
nazionale. Abbiamo quindi costruito un modello cellulare
che permettesse di studiare in vitro gli effetti di tale
mutazione.
SCOPO
SCREENING GENETICO
Pazienti SLA
numero di soggetti
213
casi familiari
26
genere (M/F)
122/91
età di insorgenza (anni)
58.3 ± 12.8
età al prelievo (anni)
60.8 ± 12.5
insorgenza bulbare
Soggetti SANI
181
102/79
67.4 ± 8.8
21.4%
durata della malattia (mesi)
31.6 ± 29.4
SOD1, VAPB e ANG positivi
nessuno
4 mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3 sporadici)
La frequenza mutazionale è risultata pertanto essere del 2.3%
calcolata sull’intera coorte di pazienti (1.6% nelle forme sporadiche
e 7.7% in quelle familiari).
RISULTATI
SCREENING GENETICO
I:1
II:1
I:2
II:2
II:3
III:2
III:3
III:4
III:5 III:6
III:7
II:2
IV:3
IV:4
IV:5
V:2
V:3
V:4
V:5
V:6
V:7
V:8
III:2
VI:2
VI:3
VI:4 VI:5
VI:6
VI:7
II:5
II:6
III:3
III:4
III:5
c.883G>A
p.Gly295Ser
IV:6 IV:7 IV:8 IV:9 IV:10
II:7
II:8
IV:2
III:6
III:7
IV:3
p.Gly348Cys
VI:8
G294V
G295S
RISULTATI
G348C
III:8
III:9
c.1144G>A p.Ala382Thr
V:9
p.Ala382Thr
VI:1
II:4
SLAf
IV:1
V:1
II:3
III:8
III:1
c.881G>T
p.Gly294Val
IV:1
IV:2
I:2
II:4
II:1
III:1
I:1
A382T
SLAs
SCREENING GENETICO
p.Gly348Cys
c.881G>T p.Gly294Val
ex1
ex2
NLS
c.883G>A
ex3
RRM1
p.Ala382Thr
p.Gly295Ser
ex4
ex5
RRM2
RISULTATI
c.1144G>A
p.Ala382Thr
ex6
GRR
Costruzione del modello cellulare
965bp 820bp
A
521bp
NdeI
ficol
mRNA
cDNA
RISULTATI
820bp
B
c.1144G>A p.Ala382Thr
BA
Validazione del modello cellulare
hHEK
45 KDa
NT
hSK-N-SH
WT A382T 45 KDa
mES
Western-Blot
NT WT A382T
45 KDa
NT
WT A382T
hHEK
actina
TDP43
Immunocitochimica
NT
hSK-N-SH
WT
A382T
mES
RISULTATI
DAPI
MERGE
Validazione del modello cellulare
GAPDH
RealTime PCR
50.00
43.02
40.00
30.00
HEK293
HEK293-A382T
20.00
TDP43
10.00
1.00
0.00
livelli di mRNA di TDP43
RISULTATI
Costruzione del modello con GFP
hHEK
TDP43WTGFP
DAPI
wt
TDP43A382TGFP
A382T
RISULTATI
TDP43
MERGE
CONCLUSIONI
GENETICA
Il quadro clinico della SLA10 è analogo a quello della malattia
classica, con qualche variabilità interfamiliare per quanto
riguarda età e sito di esordio
Paziente
genere
paese
d’origine
Belgio
Belgio
Belgio
Belgio
Belgio
Belgio
Belgio
Belgio
Belgio
Italia
Italia
ereditarietà
TDP43
età
50
53
67
39
36
54
66
58
53
50
50
insorgenza
sede
durata
(mesi)
36 a
36-48
36
-a
36
48
48
60
60 a
36
M
AD
G348C
LaA, V:3
frequenza
mutazionale
del genespinale
TARDPB nella nostra coorte di
A, V:1
M
AD
G348C
spinale
A, III:3
F risultata pari
AD al:
b
spinale
paziente
è
A, III:4
M
AD
b
spinale
A,
III:5
M
AD
b
spinale a quanto riportato in
1.6% nei casi sporadici (sovrapponibile
A, III:6
F
AD
b
spinale
A,
IV:1
M
AD
b
spinale
letteratura)
A, IV:3
M
AD
b
spinale
A,
IV:6
F
AD
b
7.7% nei casi familiari (maggiore di spinale
quanto descritto, circa il 5%).
B, III:2
B, II:5
M
M
AD
AD
A382T
b
spinale con crampi agli arti inferiori
spinale con debolezza all’arto superiore
sinistro
spinale con paresi alla mano sinistra
spinale con debolezza progressiva agli
arti inferiori
spinale con debolezza e atrofia agli arti
superiori
M
Italia
sporadica
A382Tper
54quanto riguarda le forme di
E’CD interessante
notare
come,
SLA
F
Italia
sporadica
G294V
73
36
a Etrasmissione
autosomica
dominante,
la rilevanza mutazionale
di
M
Italia
sporadica
G295S
64
36
TARDBP sia paragonabile, se non superiore, a quella di SOD1, nel
nostro come in altri studi.
DISCUSSIONE
a
CONCLUSIONI
ANALISI FUNZIONALE
Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T
abbiamo costruito due modelli cellulari per overesprimere
TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata.
hSK-N-SH
RealTime PCR mES
hHEK
45 KDa
NT
WT A382T
50.00
45 KDa
NT WT A382T43.02
40.00
45 KDa
30.00
NT
HEK293
20.00
10.00
0.00
actina
WT A382T
HEK293-A382T
1.00
livelli di mRNA di
TDP43
DISCUSSIONE
CONCLUSIONI
ANALISI FUNZIONALE
Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T
abbiamo costruito due modelli cellulari per overesprimere
TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata.
HEK non trasfettate
HEK TDP43WT
HEK TDP43A382T
45 KDa
45 KDa
1
2
3
45 KDa
1
2
1
2
3
3
mRNA non tradotto
proteina degradata
DISCUSSIONE
PROSPETTIVE
1. Proseguire la caratterizzazione genetica
2. Approfondire lo studio dei meccanismi di degradazione
proteica
3. Verificare l’eventuale regolazione dei livelli di trascritto
4. Confermare i dati fin qui ottenuti anche con i modelli
esprimenti la proteina legata alla GFP
5. Replicare gli esperimenti validati nelle HEK anche in un
modello neuronale (es. SK-N-SH)
6. Valutare i meccanismi di neurogenesi nei modelli cellulari
fin qui descritti
DISCUSSIONE
RINGRAZIAMENTI