QUANTA Lite ACA Screen III

QUANTA Lite® ACA Screen III
708620
Per uso diagnostico In Vitro
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
QUANTA LiteTM ACA Screen III è un test immunoenzimatico qualitativo per la ricerca delle IgG, IgM ed IgA
dirette contro la anticorpi cardiolipina nel siero umano. La presenza di anticorpi anticardiolipina può essere
utilizzata assieme ai riscontri clinici e ad altri test di laboratorio come ausilio per valutare il rischio di trombosi
in pazienti affetti da lupus eritematoso sistemico (LES) o altri disturbi simili al lupus.
Riassunto e Spiegazione del test
Gli anticorpi anti-cardiolipina (Anticardiolipina Antibodies, ACA) sono stati associati fortemente alla trombosi
venosa ed arteriosa.1 Questa associazione è stata osservata in principio durante studi sul lupus eritematoso
sistemico (LES), una malattia che include fra i numerosi sintomi anche la trombosi. Dei numerosi
autoanticorpi riscontrati nel LES si è scoperto che due sono diretti verso fosfolipidi come la cardiolipina.2
Principio della Metodica
L’antigene purificato cardiolipina è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in
condizioni adatte a conservare l’antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti
vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-cardiolipina eventualmente
presenti di legarsi all’antigene adsorbito. L’eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il
lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-IgGAM umane marcato con un
enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-IgGAM umane marcati con l’enzima di legarsi
agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio
per allontanare l’eccesso di anticorpi anti-IgGAM umane marcati con l’enzima, l’attività dell’enzima rimasto
viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l’intensità del colore che si sviluppa. Il
test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l’intensità del colore che si
sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli.
Reagenti
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Piastra a pozzetti ELISA in polistirene rivestita con un antigene cardiolipina purificato e β2 GPI sia
bovina (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante
Controllo ACA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza
anticorpi umani anti-cardiolipina, prediluito, 1,2mL
Controllo ACA III Screen per cardiolipina, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi
umani anti-cardiolipina, prediluito, 1,2mL
Controllo ACA III Decision Point per cardiolipina, 1 flacone di tampone contenente conservante ed
anticorpi umani anti-cardiolipina, prediluito, 1,2mL
Diluente per campioni ACA III, 1 flacone – di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata
con PBS, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL
Soluzione di lavaggio ACA III PBS Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 20x – di colore
rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con PBS, 50mL. Vedi la Sezione Metodi per le
istruzioni sulla diluizione.
Coniugato HRP IgGAM, (montone), anti-IgGAM umane, 1 flacone – di colore giallo-chiaro contenente
tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL
Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL
Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone – incolore, 10mL
Avvertenze
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Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state
testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HBsAg e per anticorpi antiHCV mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ACA III Screen, ACA III
Decision Point ed ACA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.3
La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se
ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di
piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità
di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi.
Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se
ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito
attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e
con gli occhi.
La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare
l’esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L’acido solforico è
velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche,
evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti.
I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le
normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica.
1
Precauzioni
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Questo prodotto è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.
Un lavaggio incompleto o non accurato e l’insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può
causare una scarsa precisione e/o un’elevato background.
L’adattamento di questo test all’uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per
trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli
ottenuti mediante la procedura manuale. E’ responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le
procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità.
Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l’iniziale temperatura dei
reagenti, la temperatura dell’ambiente, l’accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento,
la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre
ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione
durante l’esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati
accurati e riproducibili.
Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite.
Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale
essicante causa la degradazione dell’antigene ed una scarsa precisione nei risultati.
Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più
volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E’ importante seguire
attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente.
Un’eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria
pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio
quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato
HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l’uso di detergenti
chimici.
Condizioni di conservazione
1.
2.
3.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile
contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8°C.
Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8°C.
Raccolta dei campioni
Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L’aggiunta al campione di sodio azide o di altri
conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica,
trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso
di sieri fortemente emolizzati o lipemici.
Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell’CLSI (NCCLS)
raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura
ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in
frigorifero a 2-8°C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni,
congelare a ≤-20°C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di
essere testati.
Procedura
Materiali forniti
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Piastra microtiter ELISA cardiolipina (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
1,2mL Controllo ACA Negativo prediluito
1,2mL Controllo ACA III Decision Point prediluito
1,2mL Controllo ACA III Screen prediluito
50mL Diluente per campioni ACA III
50mL Soluzione di lavaggio ACA III PBS concentrata, 20x concentrata
10mL Coniugato HRP IgGAM, (montone), anti-IgGAM umane
10mL Cromogeno TMB
10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico
Materiali richiesti ma non forniti
Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, 200-300 e 500µL
Puntali monouso per micropipette
Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL
Acqua distillata o deionizzata
Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio ACA III PBS concentrata
Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d’onda)
Metodica
Prima di incominciare
1.
IMPORTANTE: Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26oC) e
mescolarli bene.
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2.
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4.
Diluire la Soluzione di lavaggio ACA concentrata 1:20 aggiungendo il contenuto del flacone fornito
con il kit a 950mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l’intera piastra in una sola volta, si
può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 4,0mL di concentrato a
76mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati.
Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di
Diluente per campioni ACA. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione.
NON DILUIRE i Controllo ACA III Decision Point, Controllo ACA III Screen ed Controllo ACA
Negativo.
La determinazione della presenza o dell’assenza di cardiolipina usando unità arbitrarie richiede due
pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si
raccomanda di testare i campioni in duplicato.
Esecuzione del test
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1.
TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C)
PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere
immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla
bene per minimizzare l’esposizione all’umidità ambientale.
Distribuire 100µL dei Controlli ACA III Decision Point, ACA III Screen ed ACA Negativo prediluiti e
dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura
ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l’aggiunta dell’ultimo campione.
Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire 200-300µL di
soluzione di lavaggio ACA diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per
altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l’ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla
fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E’ importante
vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l’aspirazione mantenere la
stessa sequenza usata per l’aggiunta dei campioni.
Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgGAM in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere
prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato
necessaria per l’esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE
E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i
pozzetti per 30 minuti come descritto al punto 2.
Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto 3.
Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a
temperatura ambiente.
Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l’aggiunta della Soluzione di
arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l’aggiunta del Cromogeno
TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti.
Leggere l’assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall’aggiunta della soluzione di
arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d’onda, si può usare la lunghezza d’onda di
620nm come riferimento.
Controllo di qualità
1.
2.
3.
4.
I Controlli ACA III Decision Point, ACA III Screen ACA Negativo devono essere inclusi ogni volta che
si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto.
Si deve notare che, poichè i Controlli ACA III Decision Point, ACA III Screen ed ACA Negativo sono
prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i
campioni.
Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti
regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere
preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20°C.
Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se
anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed
il test dovrebbe essere ripetuto.
a.
L’assorbanza del Controllo ACA III Screen prediluito deve essere maggiore di quella del
Controllo ACA III Decision Point prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del
Controllo ACA Negativo prediluito.
b.
Il Controllo ACA III Screen prediluito deve avere un’assorbanza maggiore di 1,0 mentre
l’assorbanza del Controllo ACA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2.
c.
L’assorbanza del Controllo ACA III Decision Point deve essere maggiore di due volte rispetto
a quella del Controllo ACA Negativo oppure >0,25.
d.
Il Controllo ACA Negativo e quello ACA III Screen servono per controllare un’eventuale
malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ACA III Screen non assicura la precisione in
corrispondenza del valore soglia del test.
e.
L’utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A3 dell’CLSI (NCCLS) per
ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità.
3
Calcolo dei risultati
1.
2.
Determinare il valore medio per tutte le letture in duplicato.
Paragonare il valore medio di assorbanza di ciascun campione a quello del Calibratore del valore
soglia. Tutti i campioni con valore di assorbanza uguale o superiore a quello del Calibratore del
valore soglia sono ritenuti sospetti di contenere IgG, IgA, o IgM anti-cardiolipina oppure miscele degli
stessi. Si raccomanda di ritestare questi campioni mediante test specifici che consentono di
individuare i singoli livelli di IgG, IgM e/o IgA anti-cardiolipina. Lo Screen di controllo ACA III
dovrebbe essere utilizzato solo per accertarsi che il sistema di analisi funzioni correttamente. L’ACA
III “Decision Point” non può essere utilizzato per ottenere risultati quantitativi in questo sistema.
Interpretazione dei risultati
Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella
popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio
dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli,
sull’apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard.
I campioni risultati positivi mediante il kit QUANTA Lite® ACA Screen III possono essere ritestati con kit
specifici per IgG, IgM o IgA anti-cardiolipina e si possono calcolare le unità GPL, MPL o APL.
NOTA: Ci si deve aspettare alcuni risultati falsi positivi quando si paragonano i risultati ottenuti con il test
ACA Screen III con quelli ottenuti con i test specifici per IgG, IgA ed IgM anti-cardiolipina. Questo è dovuto
ad una leggera ipersensibilità propria del test ACA Screen III predisposta per non perdere i campioni
debolmente positivi. Inoltre, alcuni campioni possono avere basse concentrazioni di IgG, IgA e/o IgM anticardiolipina al di sotto del valore soglia dei test singoli tuttavia l’effetto cumulativo consente al test ACA
Screen III di risultare positivo.
Limitazioni del test
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11.
12.
Il significato clinico degli ACA in malattie diverse dal LES è attualmente in fase di studio.
Quando si riscontrano titoli di ACA negativi in presenza di indicazioni cliniche, potrebbero essere
indicati un lupus anticoagulante o altre analisi aggiuntive quali anti-β2 GPI.
Non è possibile giungere alla diagnosi solo sulla base dei risultati del test ACA. I risultati di questo
test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato
degli altri test sierologici.
La terapia non deve essere instaurata basandosi solo sul risultato positivo del titolo ACA. Devono
essere presenti anche indicazioni cliniche di sostegno alla diagnosi.
Alcuni pazienti con sifilide in fase attiva o con sieropositività riportano livelli elevati di ACA. È
necessario eseguire delle analisi per escludere la sifilide.
Gli ACA possono essere presenti per un breve periodo in concomitanza con numerose infezioni. Nei
pazienti risultati positivi agli ACA è opportuno ripetere il test dopo un periodo di attesa adeguato.
Il fattore reumatoide (FR) può interferire con la determinazione degli ACA IgM III.
Alcuni campioni possono presentare contemporaneamente basse concentrazioni di anticorpi anticardiolipina delle classi IgG, IgA ed IgM. Queste concentrazioni prese singolarmente non
supererebbero la soglia di positività. Tuttavia la loro presenza simultanea può positivizzare il test di
Screen per gli ACA.
La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare
un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test.
Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.
I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del
paziente e del risultato degli altri test sierologici.
Se il concentrato PBS ACA III non viene riscaldato e mescolato accuratamente prima dell’uso,
potrebbero ottenersi risultati non uniformi.
Valori attesi
Range normale
Sono stati analizzati 491 campioni di siero di donatori di sangue normale casuali per verificare la presenza di
anticorpi anticardiolipina. Di questi, 468 sono stati classificati negativi, 21 campioni erano debolmente positivi
e due erano fortemente positivi. Di questi 23 campioni positivi, 5 erano fortemente positivi per gli anticorpi
anticardiolipina IgG (>20 GPL), 4 erano indeterminati per gli ACA IgM (<20MPL) e 6 erano fortemente
positivi per gli ACA IgM (>20 MPL) in base a esami di follow-up specifici.
Sensibilità e specificità relative
Correlazione con gli AGA Screen di seconda generazione di INOVA Diagnostics
Un totale di 626 campioni è stato analizzato sia sugli ACA Screen di seconda generazione che su quelli di
terza generazione. Questi campioni comprendono i 491 campioni normali citati nello studio sul range di
normalità come pure 135 campioni di pazienti indeterminati o positivi alla cardiolipina IgG, IgM e/o IgA. I
risultati sono riassunti qui di seguito.
QUANTA Lite® ACAScreen III (terza generazione)
+
469
13
Sensibilità relativa
ACA Screen ELISA
Specificità relativa
seconda generazione +
8
136
Efficienza relativa
4
94,4%
97,3%
96,6%
Precisione e riproducibilità
È stata valutata la precisione Inter-Test e la riproducibilità del test analizzando due volte sia un campione
risultato positivo che uno risultato negativo in quattro analisi separate. È stata valutata la precisione IntraTest e la riproducibilità del test analizzando 16 volte sia un campione risultato positivo che uno risultato
negativo in una sola analisi. L’media unità, deviazione standard ed il coefficiente di variazione per ciascun
campione sono riportati nella seguente tabella.
Generale
Intra-test
Inter-test
Positivo
Media O.D
2,671
2,702
2,641
SD
0,065
0,056
0,074
CV
2,4%
2,1%
2,8%
Negativo
Media OD
0,203
0,189
0,217
SD
0,008
0,004
0,012
CV
3,9%
2,4%
5,4%
Bibliografia
1.
2.
3.
Lancet i, 912-913 (1985).
Clinics in Rheumatic Diseases 8, 137-151 (1982).
Centers for Disease Control/National Institutes of Health Manual Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition,
2007.
QUANTA Lite e INOVA Diagnostics sono marchi registrati Copyright 2011 Tutti i diritti riservati©
Fornitore:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove
San Diego, CA 92131
United States of America
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628620ITA
July 2011
Revision 15
5