La metodologia della clonazione

Prof.ssa Cinzia Di Pietro
Alessandro Libra
Rosario Alfio Umberto Lizzio
Sebastiano Maria Miano
Stefano Perez
Cos'é la clonazione ?
 La parola "clone" deriva dal greco κλων, che
significa germoglio o ramoscello
 In biologia indica la possibilità di duplicare il
patrimonio biologico (genetico) di qualsiasi essere
vitale con produzione di individui biologicamente
uguali
 si tratta di una forma di riproduzione
a-sessuata e a-gamica
Brevi cenni storici
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1938 lo studioso tedesco Hans Spemann propose un esperimento di trasferimento nucleare dal
nucleo di una cellula differenziata
1952 R. Briggs e T.J. King misero in pratica l’esperimento proposto da Spemann 14 anni prima,
applicandolo sulla rana leopardo
1962 J. Gurdon prelevò nuclei di cellule differenziate dall’intestino di girino e le trasferì in una cellula
uobo enucleata. Utilizzando il trapianto in serie ottenne un successo del 7 % e solo / si
trasformarono in rane adulte fertili.
1972: clonazione di un frammento di DNA (molto importante per il proseguimento della ricerca)
1979: clonazione di mammiferi: si è trattato della formazione multipla di embrioni da uno solo
(separazione dei blastomeri di un embrione).
1997: prima clonazione di mammifero. Nasce la pecora Dolly dopo 297 tentativi falliti (ad opera di
Wilmut e Campbell, Glasgow – Scozia, Nature 27/2/1997). Dolly morirà nel 2003.
2000: Corea: viene interrotto lo sviluppo di cloni umani ai primi stadi di crescita
2003: Corea: viene iniziato lo sviluppo di cloni a fini terapeutici
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21/01/2004: La Società Europea di Riproduzione Umana ed Embriologica (ESHRE) condanna con
forza l’esperimento di clonazione umana annunciato il 17/01/04 dall’andrologo Zavos dell’Università
del Kentucky. Il presidente Arne Sunde ha dichiarato: E’ completamente irresponsabile e non etico
ogni tentativo di clonazione umana riproduttiva…ci sono anche seri problemi di carattere pratico,
non ultimo l’alto rischio delle nascita di bambini con anomalie anche non apparenti”
12/02/2004: Scienziati americani e sud-coreani hanno annunciato negli Usa di aver clonato per la
prima volta un embrione umano ed essere riusciti a selezionare le cosiddette cellule staminali
embrionali per una clonazione terapeutica
Cellule staminali
 Sono cellule primitive non specializzate dotate della
singolare capacità di trasformarsi in qualunque altro tipo
di cellula del corpo, si possono riprodurre illimitatamente
dando vita ad altre staminali e a cellule precursori di una
progenie cellulare destinata a differenziarsi e a dar vita a
tessuti e organi, come i muscoli, il cuore, il fegato, le ossa
ecc.
Esistono tre tipi di clonazione:
 Clonazione embrionale: è simile al processo che produce gemelli
identici. Le cellule vengono rimosse da un embrione fecondato e incoraggiati
a sviluppare in duplice copia embrioni con DNA identico.
 La clonazione riproduttiva: Mira creare una copia di un animale
esistente. DNA viene rimosso da un uovo e sostituito con il DNA prelevato da
un animale adulto, facendo un gemello genetico. Poi l'uovo fecondato,viene
impiantato in un utero e che permette di sviluppare un nuovo animale
identico al primo.
 La clonazione terapeutica: segue le stesse fasi iniziali della
clonazione riproduttiva, ma una volta che la copia di pre-embrione è stata
creata le cellule staminali vengono rimosse. Le cellule staminali possono
svilupparsi in qualsiasi tipo di cellula, così i ricercatori sperano di raccoglierle
e utilizzarle.
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“SNCT is a technique that combines an
enucleated egg and the nucleus of a somatic
cell to make an embryo”.
“SNCT è una tecnica che combina una cellula
uovo enucleata con il nucleo di una cellula
somatica per creare un embrione
Praticata per la prima volta nel 1920 da Hans Spemann per
esperimenti genetici, la SCNT è la tecnica attualmente utilizzata
per produrre cloni. Necessita di due cellule: una donatrice e una
cellula uovo. Le ricerche dimostrano che la cellula uovo, se
fecondata, accetta meglio il trasferimento nucleare. Questa
cellula infatti dovrà essere enucleata e accogliere il nuovo
nucleo prelevato dal donatore. La cellula donatrice viene forzata
ad entrare in fase G0. Il nucleo è adesso pronto per essere
inserito nella cellula uovo tramite fusione cellulare o trapianti .
L’ovocita viene stimolato a crescere e poi viene impiantato nella
madre surrogata. Se la gravidanza sarà ottimale, questo
processo darà vita a perfette repliche animali.
SCNT
somatic cell nuclear transfer
http://www.youtube.com/watch?v=Ss-z-d4mcp0&feature=related
La SCNT applicata al mondo animale
La pecora Dolly
5 luglio 1996 - 14 febbraio 2003
Ian Wilmut- Roslin Institute in Scozia
Narture 1997

•Topi-1997
Nature 1998-Università
delle Hawaii
•Inyaz- Dromedario 8 Aplile
2009
•Snuppy- cane
Sud Corea
Dubai- Biology of Reproduction
Nature 2005
•Bovino- Giappone
Science 1998
•Maiali-5 Marzo 2000
Science 2000
•Capra-Cina
Nature Biotechnology 1999
La clonazione più famosa
la SCNT della pecora Dolly
 Cellule utilizzate
 Metodologia
 Problematiche
Due pubblicazioni a confronto
La clonazione dei topi
Tecniche, successi e innovazioni
dal 1998 al 2010
La clonazione dei topi
e la tecnica di Honolulu
Nel Luglio del 1997 un gruppo di scienziati dell’università delle
Hawaii, guidati da Teruhiko Wakayama e Ryuzo Yanagimachi,
annunciò di aver clonato tre generazioni di topi. Questi erano
considerati animali molto difficili da clonare, perché, una volta
fecondato, l’uovo iniziava subito a dividersi. A Rosilin fu scelta la
pecora perché le uova non si duplicavano prima di alcune ore, e
questo diede il tempo a Wilmut di riprogrammare il nuovo nucleo.
Wakayama ha affrontato il problema della sincronizzazione dei cicli cellulari in modo
diverso rispetto Wilmut. Wilmut infatti usò le cellule della mammella, che dovevano
essere costrette alla fase G0. Wakayama, inizialmente, utilizzò tre tipi di cellule: Le
cellule del Sertoli, le cellule del cervello e cellule del cumulo. Sia le cellule del cervello
che le cellule di Sertoli, permangono nello stato G0 naturalmente mentre cellule del
cumulo sono quasi sempre in entrambi gli stati G0 o G1. Cellule uovo non fecondate del
topo sono state usate come i destinatari dei nuclei del donatore. Dopo essere state
enucleate, nelle cellule uovo sono stati inseriti i nuclei. I nuclei donatore sono stati
prelevati dalle cellule a pochi minuti dalla estrazione da un topo. Dopo un'ora, le cellule
avevano accettato il nuovo nucleo. Dopo altre cinque ore, la cellula uovo è stata poi
collocata in una cultura chimica per avviare la crescita cellulare, proprio come avviene in
natura.
Nella cultura vi era una sostanza (citocalasina B), che blocca la formazione di un corpo
polare, cellula secondaria che si crea di norma prima della fecondazione. Queste
possono poi essere trapiantate in madri surrogate e può essere così portata a termine la
gravidanza. Il maggior successo delle cellule per il processo è stato dato dalle cellule del
cumulo, per cui la ricerca si è concentrata sulle cellule di quel tipo. I risultati furono più
incoraggianti di quelli di Wilmut in quanto nelle Hawaii si ottennero tre successi su
cento tentativi, contro l’unico clone su 277 esperimenti su pecora.
a, Live oocyte surrounded by cumulus cells. The egg coat (the zona pellucida) appears in this micrograph as a relatively clear zone around the oocyte. b–e, Behaviour of cumulus
cell nuclei following injection into enucleated oocytes, photographed after fixation and staining. b, A cumulus cell nucleus within 10 min of injection. c, Transformation of the
nucleus into disarrayed chromosomes 3 h after injection. The disorder reflects an unusual situation in which single, condensed chromatids are each attached to a single pole of
the spindle and are therefore not aligned on a metaphase plate. d, 1 h after Sr2+ activation, chromosomes are segregated into two groups (mb, midbody). e, 5 h after Sr2+
activation, two pseudo-pronuclei (left and right panels) with a varying number of distinct nucleolus-like structures are discernible in each egg. The size and number of pseudopronuclei varied, suggesting that segregation of chromosomes was random after oocyte activation. f, Live blastocysts produced following injection of enucleated oocytes with
cumulus cell nuclei.
Come migliorare il tasso di successi nella tecnologia di
clonazione dei topi
di Thuan, Kishigami, Wakayama 2010
Problematiche e soluzioni
Sono passati quattordici anni da quando il primo animale è stato creato, e il tasso
di successo per tali processi ha raggiunto circa il 20% , ma solamente il 2% circa è
tipico dei topi. In questi anni sono state utilizzate molte tipologie di cellule e di
tecniche, ma i risultati non sono molto variati. Con tale pubblicazione i ricercatori
hanno dimostrato che con l’aggiunta di TSA (histone deacetylation inhibitor
trichostatin A) il tasso di successi aumentava, favorito anche dall’utilizzo di cellule
ES il cui nucleo aveva subito il processo di SCNT. Gli embrioni clonati
presentavano delle anomalie embrionali e placentari, Dna metilato e istoni
modificati, altri ancora morivano subito dopo la nascita per tumori eccetera.
Queste anomalie probabilmente riflettono un’errata regolazione della funzione dei
geni nelle cellule, causato da un aberrante riprogrammazione genica o dalla fallita
cancellazione dello stato differenziato della cellula. Ma alcuni esemplari, come
Cumulina, il primo topo clonato prodotto, hanno vissuto a lungo. La cosa
importante è che queste anomalie non sono ereditabili e non derivano nemmeno
da stirpi di topi clonati. La causa di queste anomalie poteva essere attribuita alla
SCNT o alle cellule somatiche donatrici. Si scoprì infatti che buona parte dei
cromosomi, durante lo sviluppo del pre-impianto, mostrava una segregazione
aberrante.
Si pensò allora che la causa di tutto potevano essere dei fattori di
riprogrammazione cellulare che si perdevano durante i meccanismi di SCNT
presenti nel citoplasma. Ci si accorse che pur cercando di mantenere intatto il
citoplasma, durante il processo di enucleazione, la percentuale dei successi
non variava. Si ipotizzò allora che non tutti i fattori erano localizzati nel
citoplasma, ma che alcuni erano presenti anche a livello del nucleo. Una
possibile spiegazione deriva dall’incapacità dell’ovocita di accogliere una
nucleo somatico diploide, in quanto naturalmente pronto ad accoglierne uno
aploide. Ciò poteva portare ad un basso livello di fattori di riprogrammazione.
Si provò allora a creare degli ovociti più grandi tramite elettrofusione, ma ciò
non cambiò i risultati. Si capì allora, dopo molti tentativi, che il problema
risiedeva nella conformazione dei cromosomi. L’utilizzo di TSA favorì la
nascita di alcuni cloni ma questi morirono dopo 19 giorni. Si utilizzò allora un
HDACi (histone deacetylase inhibitor) , lo scriptaid, che era meno tossico del
TSA. Ciò ha portato ad un aumento di dieci volte del numero di nascite. Non
si sa come i meccanismi intrinseci HDACi agiscano, ma si sa che questo
provoca un’iperacetilazione , influenzando la conversione in cromatina, che
permette la trascrizione, e aumentando la demetilazione del DNA, necessaria
per la riprogrammazione genica.
 Si è anche applicata la SCNT su cellule di animali congelati. Si è riusciti a clonare i
blastocisti di un bovino le cui cellule somatiche erano state congelate da tre anni, ma
non si poté stabilire se questi blastocisti fossero sani. I ricercatori di questa review
hanno allora deciso di sperimentare la SCNT, con tutte queste conoscenze acquisite, su
topi congelati per sedici anni a -20 °C senza alcuna protezione, alle stesse condizioni del
permafrost. Si sono prelevate le cellule del cervello. Queste normalmente comportano
alcune difficoltà nella clonazione, ma in tal caso furono le uniche utilizzabili.
Sorprendentemente si ebbero cloni sani alla seconda generazione di topi tramite ntES.
Questo potrebbe dar via a numerose tecniche atte a salvaguardare specie in via di
estinzione o a resuscitare animali ormai scomparsi!!!
La clonazione del dromedario
tecniche del XXI secolo
Injaz
1.
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I donatori sono indotti a ovulare su effetto di ormoni (GnRH, Gonadotropin
Releasing Hormone, e buserelin)
Dopo aver sedato l’animale, vengono prelevate le cellule uovo tramite un trasduttore.
Le cellule donatrici (cumulo, pelle dell’orecchio, e fibroblasti embionali) sono stati
sottoposte a “lavaggi” di DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) capace di far
accrescere le cellule, con l’aggiunta di FCS e tenute in coltura a determinate
condizioni di temperatura e di umidificazione.
Le cellule donatrici, impiantate in ambiente perivitellino degli ovociti enucleati,
vengono sottoposte ad elettrofusione (100 V/cm per 15 μs)
Quelli che, tenuti in coltura per 7 giorni, hanno raggiunto lo stato di morula e
blastula vengono poi impiantati nella parte sinistra del corno uterino al sesto giorno
della fase luteinica.
Solamente 6 embrioni si sono sviluppati (3 dai fibroblasti, 1 dalle cellule somatiche
dell’orecchio e 2 dalle cellule del cumulo)
Delle sei gravidanze, ha avuto vita un solo un’esemplare femmina di dromedario
chiamata Injaz. Dopo una gestazione di 378 giorni, il parto è avvenuto naturalmente
l’8 Aprile 2009, la piccola pesava 32 kg e da allora ha continuato a svilupparsi
normalmente.
The first cloned camelid, a female dromedary camel calf named Injaz: on the day of birth (a);
and 2 mo old (b), growing well (photograph taken on 8 June 2009).
Wani N A et al. Biol Reprod 2010;82:373-379
Clonazione terapeutica
 Questo tipo di clonazione ha come fine la produzione
di cellule e tessuti somatici con un genoma nucleare
identico a quello della cellula di partenza, anche se
non corrisponde alla vera e propria formazione
dell'embrione, perché è possibile interromperne la
crescita molto prima, per la sola estrazione delle
cellule staminali.
 E’ definita terapeutica perché grazie ad essa si
possono curare molte patologie alle quali non si sono
trovate altre terapie.
La clonazione terapeutica del
Prof. Liam Donaldson
 Ipotizziamo un paziente affetto da
Alzheimer, una malattia degenerativa
che colpisce innanzitutto i neuroni,
le cellule del cervello.
 Con la clonazione terapeutica, è tecnicamente possibile
creare un "clone" pre-embrionale del paziente, dal quale
estrarre le cellule staminali embrionali perfettamente e
geneticamente compatibili con quelle del paziente.
 Una volta ottenute e moltiplicate, queste fungono da
"mattoncini di riparazione" per le cellule già morte,
frenando notevolmente l'esito della malattia.
Clonare le cellule T per
sconfiggere il cancro
•Il Centro di Ricerca contro il
Cancro "Fred Hutchinson" ha
scoperto che clonando le cellule
T (T-cell) dello stesso paziente
si può bloccare il melanoma in
stato avanzato, senza l’impiego
di altre terapie.
L’esperimento
 L'esperimento è stato fatto su un paziente di 52 anni con
un melanoma in stato avanzato diffuso,da cui sono state
prelevate delle cellule T CD4+, linfociti T chiamati anche
Helper cell.
 Le cellule T del sistema immunitario, clonate in
laboratorio, sono state poi iniettate nel paziente senza
che questo avesse mai effettuato terapie contro il cancro.
 Due mesi dopo l’iniezione di cellule T, l’esame PET/TAC
ha dimostrato l’assenza di masse tumorali fino a due anni
dopo la somministrazione.
Cos’è successo:
E' stato ipotizzato che l’iniezione di
una grande quantità di cellule T
CD4+ persista a lungo nel corpo
perché le cellule sono in grado di
produrre il proprio fattore di
crescita, l’interleuchina 2, mentre
stimolano l’effetto antitumorale
delle cellule T CD8+, linfociti
citotossici
che
distruggono
qualsiasi tipo di cellula infettata,
tumorale o non riconosciuta come
accade nei rigetti associati ai
trapianti.
Interleuchina-2, viene impiegata
nei laboratori per clonare le cellule
T. Studi clinici hanno testato la sua
utilità contro le forme tumorali, ma
comporta una tossicità troppo
elevata,se messa a confronto con i
risultati.
 Fino a poco tempo fa non era ritenuto possibile
isolare e far espandere le cellule T CD4+ antitumorali
in laboratorio.Il paziente, invece, ha ricevuto 5
miliardi di cellule CD4+ clonate e cresciute
appositamente per riconoscere e distruggere le cellule
metastatiche del melanoma presentanti l’antigene
NY-ESO-1 (EOC) .
Il risultato finale
 Le cellule sono rimaste per circa 80 giorni nel corpo
del paziente, anche se soltanto il 50 – 75 % delle
cellule tumorali esprimono l’antigene NY-ESO-1. Il
risultato finale è stato che l’intero tumore è regredito
dopo l’iniezione.
 Gli scienziati hanno quindi pensato che la risposta
immunitaria dell’organismo si è estesa ad altri
antigeni espressi dalle cellule del tumore.
È possibile trasferire tessuto cutaneo da una parte
all'altra della stessa persona (trapianto autogeno),
come pure da un donatore a un ricevente (trapianto
allogenico).

Il trapianto di pelle autogeno è considerato la miglior terapia in caso di
lesioni estese, ad esempio in caso di ustioni gravi.

Il trapianto allogenico è impiegato per la
copertura temporanea di difetti cutanei estesi
o ferite problematiche. La pelle trapiantata è
rigettata, ma la secrezione di determinati
messaggeri chimici indotta dalla terapia può
aiutare la ferita a cicatrizzarsi.
Nella prima fase si prelevano dalla pelle del paziente tre tipi di cellule
staminali con diverse caratteristiche: i cheratinociti, che consentono di
riparare la pelle; i fibroblasti, che consentono di ricostruire lo strato
profondo; i melanociti, che hanno il compito di dare colore alla pelle.
Successivamente si deve attendere
circa un mese per la coltivazione
delle staminali dalle quali si sviluppa
la pelle.
In seguito viene divisa in pezzi da
8x8 cm, ( il numero di quadrati
preparati dipende dell'estensione
dell'area da coprire ).
Infine viene impiantata la pelle e
questa attecchisce coprendo l'area
della lesione.
Se gli ustionati hanno ancora
sufficienti aree di pelle intatta, queste
vengono utilizzate per il trapianto
autogeno.
 Le zone di prelievo si rigenerano
spontaneamente, seppure di tonalità
diversa.
 Gli innesti vengono suturati oppure
fissati con collanti o bendaggi.
 Se l'innesto prelevato è a forma di
rete, è possibile estenderlo per coprire
una superficie fino a tre volte
superiore a quella originale. Con il
tempo, tuttavia, questi cosiddetti
innesti a maglia (Meshgraft) tendono
a contrarsi, formare cicatrici e a
mostrare un colore diverso dalla cute
adiacente.

Se gli ustionati gravi non hanno più sufficiente pelle
sana, per coprire le zone ustionate si deve ricorrere
alla pelle di un donatore. Il trapianto allogenico di
pelle completa, però, viene rigettato dal sistema
immunitario del paziente dopo 10-20 giorni. Questo
lasso di tempo viene spesso sfruttato per far crescere
piccoli lembi di tessuto del paziente stesso in cultura
tessutale, in modo da ottenere lembi più grandi da
innestare.
Le cellule sono trattate con virus che hanno inserito il gene Oct4 e proteine
immuno-stimolanti chiamate citochine; esse si legano al DNA ed agiscono come
un interruttore on / off , accendendo o spegnendo circa 2.000 geni. Così facendo le
cellule cutanee vengono riprogrammate in cellule progenitrici del sangue.
Oct4 è uno dei pochi fattori utilizzato da Yamanaka per trasformare i fibroblasti in
cellule iPS, ma la squadra di Bhatia, durante gli esperimenti, non ha trovato alcuna
prova che le cellule progenitrici del sangue erano passate attraverso uno stato
embrionale. Pattern di espressione genica delle cellule non somigliavano a quelle
delle cellule staminali embrionali e le cellule progenitrici del sangue non
sviluppavano nei topi teratomi, tumori caratteristici delle cellule pluripotenti.
http://www.frontsidebus.net/2010/11/scientists-turn-skin-intoblood-vidoe/
Il ricorso alla clonazione terapeutica è controverso per diversi motivi.
Sotto il profilo scientifico il non è chiaro se il metodo funzioni
effettivamente anche sull’uomo. Permane il dubbio che le cellule
staminali così ottenute siano troppo “vecchie”, visto che il loro
genotipo proviene da una cellula matura. Il tessuto ottenuto
partendo da queste cellule potrebbe perdere la propria funzionalità o
degenerare in un cancro.
Tuttavia nel contesto medico oltre ai problemi di natura biologica, si
inseriscono i problemi etici…
Orientamento della comunità scientifica
Due fronti di pensiero esistono per la clonazione terapeutica
•Il fronte dei laici considera l’embrione persona dal 14° giorno di vita,
quindi ammette il sacrificio per il prelievo delle cellule staminali prima
di tale periodo (Americani e Inglesi)
•Il fronte cattolico considera l’embrione come persona fin dal suo
concepimento, quindi è contrario al sacrificio degli embrioni.
Tuttavia sono favorevoli all’uso delle cellule staminali prelevate
dall’adulto
La via del TNSA, se facilmente percorribile, sarebbe la più
idonea in quanto eluderebbe il problema etico delle cellule
embrionali, perché non può essere considerato embrione se
questo deriva da una replicazione asessuata, ed eviterebbe
anche il grave problema del rigetto, trattandosi di cellule
autologhe provenienti, cioè, dallo stesso individuo e quindi con
lo stesso patrimonio genetico. In pratica, il procedimento
definito TNSA, trasferimento nucleare di cellule staminali
autologhe, consiste nell'inserire un nucleo di cellula adulta
prelevata dal paziente in un ovocita privato del proprio nucleo.
“Che cosa fa di un uomo un uomo? La circostanza del suo concepimento o
quella della sua vita? chi ci garantisce che il perfetto clone di un pugile
possa decidere di indossare i guantoni, anziché suonare il violino? Un
genitore che clonasse se stesso ha almeno il cinquanta per cento di
probabilità di rimanere deluso"
Leo Klass
“Nuova biologia e vecchia morale”
•Metodologia della clonazione
•http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20203432
•http://www.aaas.org/spp/cstc/briefs/cloning/
•http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19812298
•http://www.biolreprod.org/content/82/2/373.long
•http://stemcells.nih.gov/StemCells/Templates/StemCellContentPage.aspx?
NRMODE=Published&NRNODEGUID=%7b3C35BAB6-0FE6-4C4E-95F2-2CB61B58D96D
%7d&NRORIGINALURL=%2finfo%2fglossary%2easp&NRCACHEHINT=NoModifyGuest#scnt
•http://www.accessexcellence.org/WN/SUA12/mouseclub798.php
•http://www.nature.com/nature/journal/v394/n6691/full/394369a0.html
•http://www.nature.com/news/1998/980730/full/news980730-1.html
•http://news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/5098286.stm
•http://library.thinkquest.org/24355/data/details/media/honoluluanim.html
•http://animalscience.ucdavis.edu/animalbiotech/biotechnology/cloning/index.htm
•Applicazioni terapeutiche 1
http://medgadget.com/archives/2008/06/t_cell_cloning_as_potential_cancer_treatment.html
http://salute.aduc.it/staminali/articolo/cosa+sono+cellule+staminali+perche+clonazione_6895.php
•Applicazioni terapeutiche 2
•http://www.canada.com/health/Canadian+scientists+transform+human+skin+into+blood/3793787/story.html#ixzz
16UPmTqz3
•http://www.nature.com/news/2010/101107/full/news.2010.588.html
•http://www.universonline.it/_scienza/articoli_med/06_03_02_a.php
•http://www.physorg.com/news/2010-11-scientists-skin-blood.html