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Geni che regolano la divisione
cellulare
!Geni il cui prodotto
proteico promuove un
aumento del numero
di cellule (oncogeni)
Oncogeni
= acceleratori
!Geni il cui prodotto
proteico induce una
riduzione del numero
Oncosoppressori = freni
di cellule
(oncosoppressori).
Oncosoppressori:
definizione
Geni che , attraverso alterazioni genetiche, subiscono
una perdita di funzione. Agiscono quindi in maniera
recessiva (un singolo allele non e’ capace di produrre
l’effetto oncogenico). La maggior parte di questi geni
codifica per proteine coinvolte in vari meccanismi di
controllo della crescita e della sopravvivenza cellulare
Oncosoppressori: classi
funzionali
I.
Gatekeepers: regolano negativamente la
crescita cellulare o inibendo la proliferazione o
inducendo la morte. La loro inattivazione
induce direttamente un’aumento della crescita
cellulare.
II. Caretakers: regolano la integrita’ genomica. La
loro inattivazione non causa un’aumento della
crescita cellulare, ma un’aumento del rate di
mutazione dovuta ad instabilita’ genetica.
Oncosoppressori: Definizione
Oncosoppressori: Scoperta
Oncosoppressori: Meccanismi di
inattivazione
Oncosoppressori: Scoperta
I. Esperimenti con ibridi somatici
II. Retinoblastoma: ipotesi di Knudson
III. Citogenetica
Analisi di linkage
Perdita di eterozigosi
IV. Saggi funzionali di reversione del fenotipo
Ibridi somatici
Oncosoppressori: Scoperta
I. Esperimenti con ibridi somatici
II. Retinoblastoma: ipotesi di Knudson
III. Citogenetica
Analisi di linkage
Perdita di eterozigosi
IV. Saggi funzionali di reversione del fenotipo
Retinoblastoma
Sporadico
Ereditario
Retinoblastoma familiare
Individuo affetto
Individuo non
affetto
Ipotesi di Knudson
- I tipici geni oncosoppressori sono recessivi
-C’e’ bisogno dell’inattivazione dei due alleli (“two hits”,
Knudson 1971)
Inattivazione del gene RB secondo il modello di Knudson
Frecce=mutazione; Geni in blu=inattivazione
Oncosoppressori: Scoperta
I. Esperimenti con ibridi somatici
II. Retinoblastoma: ipotesi di Knudson
III. Citogenetica
Analisi di linkage
Perdita di eterozigosi
IV. Saggi funzionali di reversione del fenotipo
Alterazioni citogenetiche
In circa il 5% di retinoblastomi ereditari, era evidente una tipica
alterazione citogenetica, una delezione interstiziale della banda q14
del cromosoma 13
Perdita di eterozigosi (LOH)
L’ inattivazione del secondo allele del gene oncosoppressore puo’ essere
evidenziata come perdita di eterozigosi di un marcatore polimorfico che e’ in
linkage con il locus del gene oncosoppressore
Cellula normale
Cellula pre-tumorale
Mutazione in un
allele
Normal Tumor
Cellula tumorale
Perdita del
secondo allele
(puo’ avvenire
anche per
conversione
genica o
ricombinazione
mitotica)
Ellettroforesi su gel di prodotti di PCR di
marcatori polimorfici che si trovano in
vicinanza dell’oncosoppressore
Oncosoppressori: Scoperta
I. Esperimenti con ibridi somatici
II. Retinoblastoma: ipotesi di Knudson
III. Citogenetica
Analisi di linkage
Perdita di eterozigosi
IV. Saggi funzionali di reversione del fenotipo
Saggi Funzionali
Huang et al., 1988
Ricostituzione di Rb in una linea tumorale RB-/- (WERI-Rb27)
Rb
XX
Tumore +
Tumore -
Cellule tumorali
Cellule revertite
Oncosoppressori: Definizione
Oncosoppressori: Scoperta
Oncosoppressori: Meccanismo di
inattivazione
Oncosoppressori: meccanismi di
inattivazione
Meccanismi di inattivazione del secondo
allele
Non disgiunzione
mitotica
Inattivazione del
secondo allele
Non disgiunzione e
duplicazione
Inattivazione di
un allele
Ricombinazione
mitotica
Conversione genica
Cellula
normale
X
Cellula
pre-tumorale
Mutazione puntiforme
Delezione
Silenziamento
(meccanismi epigenetici)
Cellula tumorale
Oncosoppressori: classi
funzionali
I.
Gatekeepers: regolano negativamente la
crescita cellulare o inibendo la proliferazione o
inducendo la morte. La loro inattivazione
induce direttamente un’aumento della crescita
cellulare.
II. Caretakers: regolano la integrita’ genomica. La
loro inattivazione non causa un’aumento della
crescita cellulare, ma un’aumento del rate di
mutazione dovuta ad instabilita’ genetica.
Oncosoppressori: classi
funzionali
Normale
neoplasia
Pathway dei gatekeeper
Pathway dei caretaker
Mutazione di
un allele di
un caretaker
Mutazione del
secondo allele
del caretaker:
instabilita’ genetica
Mutazione di
un allele di
un gatekeeper
Mutazione del
secondo allele
del gatekeeper
Stimolo Mitogenico
Antioncogèni
Oncosoppressori
Trasduzione del segnale
dalla membrana al citoplasma
e dal citoplasma al nucleo
Regolazione dell’espressione
delle molecole del ciclo di
divisione cellulare
Innesco del ciclo di
divisione cellulare
Replicazione cellulare
Gatekeepers: RB
Proteina codificata dal gene RB, responsabile di un tumore dell’occhio
Regolatore negativo del ciclo cellulare
Repressore trascrizionale
Lega ed inattiva il fattore di trascrizione E2F, che regola positivamente
la trascrizione di geni necessari all’entrata in fase S
La sua funzione e’ regolata negativamente durante il ciclo cellulare
da fosforilazione ad opera dei complessi CDK4-ciclina D,
CDK6-ciclina D o CDK2-ciclina E.
Figure 8.1 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.3b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.6 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.7 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Le chinasi ciclina-dipendenti
(CDK)
Defosforilazione
di una tirosina
Presenza
della ciclina
Fosforilazione di
una treonina
P
P
La chinasi si attiva solo quando sono soddisfatti questi tre criteri
Cyclin
s in
Inattiva
te s
i
Cyclin
Cdk
Cyclin
Cdk
Cyclin
Cdk
-T-P
(160)
Cdk
-T-P
(160)
15-
CAK
Wee1
Y-P
inattiva
attiva
Cyclin
Cyclin
Cdk
Cdk
-T-P
-T-P
(160)
15-
(160)
15-
Y-P
Cdc25
Y
Figure 8.8 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.9 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.10 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Table 8.1 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.12 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.13a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
TGF-beta
Figure 8.14a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Stimolo mitogenico
Sintesi cicline D
Aumento di attivita’ di
CiclineD-Cdk4,6
Superamento del restriction point
G1
S
Come i complessi CDK-ciclina promuovono
la
progressione del ciclo cellulare
Fosforilazione di specifici substrati
- Componenti del ciclo cellulare stesso Es. p27
- Lamina nucleare
- pRB: substrato critico
Struttura di pRb
A/B pocket
TSSTTT
SSS
A
B
SSSSS TT
C-term
NLS
LXCXE delle
proteine E2F
sito di legame
Ciclina/CDK
Struttura e funzione dell’AB pocket
" L’A/B pocket e’ necessario per le funzioni
biologiche;
Regolazione della crescita e della differenziazione
"L’A/B pocket e’ necessario per le funzioni
biochimiche;
Regolazione trascrizionale, interazione con
proteine che contengono un motivo LXCXE.
Struttura e funzione dei domini C ed Nterminali
Regione C-terminale
"Critica per la funzione di soppressione della crescita
"Contiene un dominio di localizzazione nucleare e un sito
"di legame per la ciclina (R/KXL).
"Interagisce e regola l’AB pocket.
Il dominio N-terminale, anche lega il pocket e
ne regola la funzione
Figure 8.19 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.22 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.23a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
G1
S
Rb
D
e
in
l
c
ci
e
l
l
Cyc D1,2,3
e
d
si
e
t
Sin
Cdk4,6
Stimolo Mitogenico
E2F
Sintesi di
ciclina E
Cyc E
Cdk2
Geni regolati da E2F
Cdk2
E2F/DP
ciclina E
Richiesti per la
replicazione del DNA
ciclina A
Altri geni
Geni della replicazione (DNA polimerasi !)
Geni della biosintesi dei nucleotidi (timidina
chinasi)
Geni del riparo del DNA (RAD51)
Fattori dell’origine di replicazione
Gene
Funzione
Rb
Regolaz.
ciclo cellulare
Tumori associati a
mutazioni somatiche
Tumori associati
a mutazioni ereditarie
Retinoblas. Osteosarc. carc.
Polmone, Colon, Mamm.
Retinoblas. Osteosarc
Cellule retiniche normali: Proliferazione controllata
Rb
Retinoblastoma
G1
Cicline D +
Cdk4,6
S
Ciclina E +
Cdk2
Retinoblastoma
Proliferazione
Non controllata
Rb
Induzione costitutiva
di
Ciclina E +
Cdk2
Proliferazione