Riarrangiamento dei geni per le Immunoglobuline e sviluppo dei

Riarrangiamento dei geni
per le Immunoglobuline e
sviluppo dei linfociti B
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• I geni che codificano i recettori per gli antigeni
(BCR e TCR) sono presenti in uno “stato” non
funzionale nella linea germinale
• Diversi eventi di ricombinazione devono avvenire
durante lo sviluppo di ciascun linfocita per rendere
funzionali questi geni
• Ciascun evento richiede l’introduzione di doppie
rotture nel DNA cromosomico
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Chromosome localization of Ig loci
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• Sia le catene leggere che le catene pesanti sono
codificate da famiglie multi-geniche separate
• Nel DNA della linea germinale ciascuna famiglia multigenica contiene diverse sequenze codificanti, dette
segmenti genici, separate da regioni non codificanti
• Durante la maturazione dei linfociti B questi segmenti
genici vengono riarrangiati
• Il riarrangiamento crea un esone funzionale
corrispondente alla regione variabile
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La regione VL è codificata
da più di un segmento genico
• La regione variabile della catena leggera (VL) è
codificata da 2 segmenti genici
– segmento genico V
• codifica per i primi 95-101 a.a.
– segmento genico J
• codifica per pochi a.a. (fino a 13)
Il riarrangiamento dei segmenti V e J crea un esone (VJ)
che codifica per l’intera regione VL
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Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig
VL
CL
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La regione VH è codificata
da più di un segmento genico
• La regione variabile della catena pesante (VH) è
codificata da 3 segmenti genici
– segmento genico V
– segmento genico D
– segmento genico J
Il riarrangiamento dei segmenti V, D e J crea un esone (VDJ)
che codifica per l’intera regione VH
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Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig
VH
Cm1
Cm2
Cm3
Cm1
Cm2
Cm3
Cm4
TM
Cyt
Cm4
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Germline organization of Ig light- and
heavy-chain loci in human genome
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Riarrangiamento catena k
DNA catena k germ-line
V-J joining
DNA catena k riarrangiato
Trascrizione
Trascritto primario catena k
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Trascritto primario catena k
RNA splicing + poliadenilazione
Coda poli-A
mRNA catena k
Traduzione
Polipeptide nascente catena k
Catena k
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Riarrangiamento catena pesante
DNA catena H germ line
D-J joining
V-DJ joining
DNA catena H riarrangiato
Trascrizione
Trascritto primario
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Trascritto primario catena H
splicing alternativo
mRNA catena H
Polipeptide nascente catena H
Catena H
Catena Hm
Catena Hd
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Co-espressione di IgM e IgD
• Nelle cellule B naive il trascritto primario della catena
pesante contiene sia gli esoni per i domini costanti della
catena m che della d
– il trascritto primario non contiene esoni per altre catene pesanti (g, e, a)
• Attraverso lo splicing alternativo vengono prodotti sia
mRNA per m che per d
• La cellula B naive co-esprime IgM e IgD con la stessa
specificità antigenica
– stesso esone VDJ per dominio variabile delle catene pesanti m e d
– catena leggera associata identica
• Le altre classi di Ig non sono mai co-espresse
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Recombination Signal Sequence, RSS
• Accanto a ciascun segmento genico sono presenti delle
sequenze dette recombination signal sequences (RSS)
– 1 RSS è collocata al 3’ di ciascun segmento V
– 1 RSS è collocata al 5’ di ciascun segmento J
– 1 RSS è presente al 5’ e un’altra al 3’ di ciascun segmento D
• Queste sequenze funzionano da segnali per i processi di
ricombinazione
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Recombination Signal Sequence, RSS
• Ciascuna RSS contiene
– NONAMERO: sequenza conservata non codificante di 9 nucleotidi
• sito di legame per RAG1; ancora le proteine RAG al DNA
– EPTAMERO: sequenza conservata non codificante di 7 nucleotidi
• aumenta legame di RAG, specifica sito di taglio
– eptamero e nonamero sono separati da uno “spacer” di 12 o 23
paia di basi
• lo spacer varia di sequenza ma la sua lunghezza è conservata e
corrisponde a uno (12 bp) o due (23 bp) giri di DNA doppia elica
• la lunghezza dello “spacer” è cruciale per la ricombinazione
– permette corretta giustapposizione di nonamero ed eptamero
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Sequenze RSS
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“Regola 12/23”
Un segmento genico fiancheggiato da una RSS con uno spacer di 12 bp può
ricombinare con un segmento fiancheggiato da uno spacer con 23 bp
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Il complesso della ricombinasi V(D)J
• Il complesso di enzimi che opera la ricombinazione somatica
V(D)J è detto ricombinasi V(D)J
• Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2
– i prodotti di questi geni costituiscono la componente della ricombinasi
specifica dei linfociti (B e T)
• necessari per la generazione dei recettori per l’antigene
– topi KO per uno dei due geni Rag non sviluppano linfociti B né T
• sono espressi durante lo sviluppo dei linfociti solo quando avviene il
riarrangiamento dei geni per il recettore dell’antigene
• La ricombinasi V(D)J include anche enzimi espressi
ubiquitariamente e coinvolti nella riparazione del DNA
– DNA ligasi IV, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), Ku70/80,
Artemis
• La ricombinazione avviene alle giunzioni tra le sequenze RSS e le
sequenze codificanti
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Recombinant-Activating Genes:
RAG-1 e RAG-2
• Proteine nucleari, altamente conservate in vertebrati
• Costituiscono la componente della ricombinasi specifica
dei linfociti (B e T)
• Necessari per la generazione dei recettori per l’antigene
• Il core di RAG-1 contiene
– regione per legame a nonamero
– regione centrale che interagisce con eptamero e RAG2
– sito catalitico per taglio DNA
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Recombinant-Activating Genes:
RAG-1 e RAG-2
• Il core di RAG-2
– è necessario per il taglio del DNA
– interagisce con RAG1
– aumenta l’affinità di legame con il DNA
• RAG2 contiene una regione che lega la lisina 4
trimetilata dell’istone H3 (H3K4me3)
– guidando il complesso RAG nelle regioni di cromatina attiva
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Fasi della ricombinazione 1
• RAG1 e RAG2
riconoscono RSS
– (alla formazione del complesso
partecipano anche altre proteine)
• le RSS di un segmento V e
di uno J sono portate in
prossimità
Segmento genico V
RSS - 1 giro
Segmento genico J
RSS - 2 giri
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Fasi della ricombinazione 2
• taglio di un filamento di
DNA da parte di RAG-1 e
RAG-2 alla giunzione
delle RSS con le
sequenze codificanti
– tra eptamero e segmento
genico codificante
Segmento genico V
RSS - 1 giro
Segmento genico J
RSS - 2 giri
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Fasi della ricombinazione 3
• l’estremità tagliata del
segmento genico codificante,
viene unita al filamento
opposto producendo una
“forcina”
• all’estremità della RSS,
viene prodotta una doppia
rottura del DNA
Segmento genico V
RSS - 1 giro
Segmento genico J
RSS - 2 giri
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Ricombinazione 4
• Vengono reclutate altre proteine
– Ku70/Ku80
• La forcina viene tagliata in
posizione casuale
– RAG/Artemis
– l’estremità viene poi modificata da
• esonucleasi
• TdT (terminal deoxynucleotidyl
transferase)
• Riparo e legame delle sequenze
codificanti e di quelle segnale
– DNA ligasi IV
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Generazione della diversità anticorpale
(GOD, Generation Of Diversity)
• Molteplici segmenti genici
– diverse combinazioni V-(D)-J
• Flessibilità nel processo di giunzione
– aggiunta e rimozione di nucleotidi
• Combinazione di catene pesanti e leggere
• Ipermutazione somatica
– in linfociti B attivati
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200
6x103
=
1.2x106
120 x 6x103
=
0.72x106 =
x
Possibili combinazioni teoriche
+
1.92x106
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Variabilità degli aminoacidi nelle Ig
FigureHV3
3-6
HV3
ha
ha una
una
variabilità
varibilità maggiore
maggiore
di
di HV1
HV1 ee HV2
HV2
Regione V catena leggera
Variabilità
Variabilità
Regione V catena pesante
FR, frame region
HV, hyper-variable region
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La regione del DNA dove avviene la giunzione V(D)J
codifica per la regione ipervariabile 3 (HV3) che
corrisponde al CDR3
HV1
HV2
HV3
HV regions
HV1
HV2
HV3
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Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
Eptamero della RSS
Eptamero della RSS
• l’estremità tagliata del
segmento genico
codificante, viene unita al
filamento opposto
producendo una “forcina”
• (v. diapo precedenti)
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Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
(P-addition)
• Il taglio della forcina genera un
filamento singolo
• Gli enzimi di riparazione
aggiungono nucleotidi
complementari a questa
sequenza generando una
sequenza palindromica
– P-nucleotidi
• Variazioni nella posizione del
taglio della forcina generano
variazioni in questa sequenza
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Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
(N-addition)
• Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
(TdT) aggiunge fino a 15 nucleotidi alle
giunzioni D-J e V-DJ.
• I nucleotidi aggiunti generano
sequenze randomiche
• La N-addition contribuisce largamente
alla variabilità del CDR3 della catena
pesante
• La N addition si verifica quasi
esclusivamente nella catena pesante
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Diversità totale
(combinazioni
V(D)J e catene
L/H + diversità
giunzioni N/P
addition)
Ig
TCRab
11
10
16
10
Tuttavia, in un determinato momento ciscun individuo ha un
repertorio di circa 107 cloni B e T
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Esclusione allelica
• Ciascuna cellula B esprime i geni riarrangiati
della catena pesante di un solo cromosoma e
i geni riarrangiati della catena leggera di un
solo tipo (k o l) e di un solo cromosoma
– esclusione allelica
• Assicura che una cellula B funzionale
esprima una sola catena pesante e una sola
leggera
 una sola specificità antigenica
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Esclusione allelica in singole cellule B
Ceppo di aplotipo
“a/a” per la catena
pesante delle Ig
Ceppo di aplotipo
“b/b” per la catena
pesante delle Ig
Ibrido F1 di aplotipo
“a/b” per la catena
pesante delle Ig
I due aplotipi diversi
sono espressi
in cellule diverse
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