TERRENI DI COLTURA

La coltivazione dei microrganismi
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TERRENO DI COLTURA
Miscela di composti biologici o sintetici, organici o minerali, capace di fornire un ambiente adatto
alla crescita di un particolare tipo di microrganismo
A) In base allo stato fisico 1) TERRENI LIQUIDI
2) TERRENI SOLIDI
B) In base alla composizione chimica
Classificazione dei
terreni di coltura
1) TERRENI MINIMI: contengono in composizione nota solo
sali inorganici
2) TERRENI SINTETICI: contengono in composizione nota sia
composti organici sia inorganici
3) TERRENI COMPLESSI (RICCHI): ricchi di substrati
organici di cui non tutti I componenti sono noti (estratti di lievito
o di organo). Sono usati per l’isolamento di microrganismi
nutrizionalmente esigenti
C) In base alla funzione
1) TERRENI SELETTIVI
2) TERRENI DISCRIMINATIVI
3) TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO
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TERRENI DI COLTURA:
classificazione in base allo stato fisico
LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH)
SOLIDI: contengono AGAR
L’AGAR è estratto dall’alga marina agar-agar ed è costituito dal polisaccaride AGAROSIO
L’AGAROSIO è un polimero lineare con
peso molecolare di 120 kDa, costituito da
D-galattosio e 3,6-anidro-Lgalactopiranoside alternati e uniti da
legami glicosidici α-(1→3) e β-(1→4)
- Non è un nutriente, ma viene utilizzato come agente solidificante nei
terreni di coltura
- L’agar è ottimale per la preparazione dei terreni di coltura solidi perché ha
una temperatura di liquefazione di 100°C e di solidificazione a 45°C
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TERRENI DI COLTURA: classificazione in base alla funzione
TERRENI SELETTIVI:
sono terreni di crescita adatti alla moltiplicazione di uno specifico
microrganismo o di un numero ristretto di microrganismi e che sfavoriscono la crescita di altri
microrganismi
campione contenente il microrganismo da
studiare (un alimento, del suolo, un tampone
faringeo o cutaneo, un campione fecale, etc…)
Il terreno selettivo sfavorisce
(o impedisce) la crescita dei
batteri che non voglio isolare
Quali agenti selettivi sono solitamente sfruttate le esigenze nutrizionali (capacità di metabolizzare
specifici substrati), la capacità di resistere alla presenza di antibiotici o altre molecole
antimicrobiche, la capacità di sopravvivere a bassi pH o elevate concentrazioni di sali o zuccheri…
Esempi
Salmonella-Shigella Agar (SS-agar): utile all’isolamento dei batteri patogeni Gram negativi dei
generi Salmonella e Shigella; questo terreno inibisce la crescita della maggior parte dei batteri a
causa dell'elevata concentrazione di sali biliari e di citrato di sodio
Bifidobacterial Selective Medium: utile all’isolamento dei bifidobatteri; contiene come agenti
selettivi il sale litio cloruro, l’acido propionico e alcuni antibiotici a cui i bifidobatteri sono
naturalmente resistenti
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TERRENI DISCRIMINATIVI:
rendono possibile alle colonie di un dato
microrganismo di svilupparsi assumendo un aspetto tale da essere riconosciuto e
distinto a prima vista dalle colonie degli altri microrganismi
ESEMPIO
Agar sale mannite: contiene lo zucchero MANNITOLO (come unica fonte di carbonio) e
rosso fenolo (indicatore di pH); permette di discriminare gli stafilococchi patogeni
(Staphylococcus aureus) dagli altri stafilococchi (per es. Staphylococcus epidermidis)
LA CRESCITA DEL MICRORGANISMO DA
UNA COLORAZIONE GIALLA poichè la
fermentazione del mannitolo produce acidi che
fanno virare il colore dell’indicatore di pH
(rosso fenolo) al giallo; esempio: S. aureus
LA CRESCITA DEL BATTERIO NON
CAMBIA IL COLORE DEL TERRENO: il
batterio non fermenta il mannitolo; le
colonie batteriche rimangono del colore
iniziale del terreno; esempio: S. epidermidis
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TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO: sono terreni liquidi in cui la presenza
di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero
delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici
ESEMPIO
Terreno di coltura al selenio per l’isolamento delle salmonelle dalle feci
Batterio che voglio isolare
(per es. Salmonella typhi)
Altri microrganismi
presenti nel campione
Dopo circa 6/8 ore il numero di cellule del batterio di interesse sarà di molto cresciuto rispetto
al numero di cellule degli altri microrganismi (il batterio di interesse è stato arricchito!)
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PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA
- pesata dei vari costituenti
Terreno di coltura NUTRIENT
(terreno COMUNE)
- dissoluzione in acqua
- sterilizzazione in autoclave
peptone
Idrolizzato di proteine
del latte, della carne o
della soia con pepsina
estratto di carne 1 g
estratto di lievito 2 g
X BATTERI nutrizionalmente poco esigenti sodio cloruro
acqua dist.
Terreno di coltura BRODO
MALTO o AGAR MALTO
estratto di malto
20 g
saccarosio
40 g
estratto di lievito
acqua dist.
5g
5g
1000 ml
5g
1000 ml
X LIEVITI E MUFFE
TERRENO MRS
(per lattobacilli)
Sono microrganismi
nutrizionalmente esigenti
(detti per questo
FASTIDIOSI); affinché
possano essere coltivati,
quindi, necessitano di un
terreno colturale più ricco
in nutrienti
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de Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI
Peptone from casein
10.0g;
meat extract
8.0g;
yeast extract
4.0g;
D(+)-glucose
20.0g;
dipotassium hydrogen phosphate
2.0g;
®
Tween 80
1.0g;
di-ammonium hydrogen citrate
2.0g;
sodium acetate
5.0g;
magnesium sulfate
0.2g;
manganese sulfate
0.04g;
agar-agar (not present in MRS broth)
14.0g
acqua dist.
1000 ml
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CONCETTO DI STERILITÀ
STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente,
(comprese le endospore di Bacillus e Clostridium)
In un laboratorio di microbiologia la sterilità DEVE essere assoluta. Nelle
industrie alimentari è un concetto statistico (si pensi alle leggi di BIGELOW,
che rappresentano la cinetica della distruzione termica dei microrganismi)
Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il CALORE
PERCHÉ? Principalmente perché le proteine (e quindi anche
gli enzimi) denaturano
Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia è:
L’AUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto pressione
(assai più efficace del CALORE secco)
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L’AUTOCLAVE
- Il ciclo di sterilizzazione prevede
una sovrapressione di 1 atm (≡
121°C) per un tempo di15 min
(oppure 20 min x ¾ atm ≡ 116°C;
oppure 30 min x ½ atm ≡ 111°C)
- P/T minori e tempi maggiori per
limitare il danno ai composti organici
(imbrunimento, caramellizzazione)
- il vapore deve poter entrare in
contatto con le soluzioni (tappi di
cotone; bottiglie aperte)
N.B.: Molti zuccheri e gli antibiotici devono essere sterilizzati per
filtrazione (cut-off del filtro di 0,45 o 0,22 µm) perché altrimenti
il
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calore dell’autoclave distruggerebbe queste molecole
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Lavorare in sterilità
Ansa
Pipetta
Spatola
Becco Bunsen
Si lavora con fiamma ossidante
(azzurra, più calda, più stabile),
NON si lavora con la fiamma
riducente (gialla, instabile)
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riducente ossidante
LA SEMINA DEI TERRENI DI COLTURA
Consiste nel trasferire sterilmente le cellule del microrganismo allo studio in un brodo
colturale o in una piastra di terreno colturale agarizzato
SEMINA DI TERRENO SOLIDO
STRISCIO
SPATOLAMENTO
INOCULO
IN BRODO
Trasferimento in
sterilità di cellule nel
terreno liquido con
ansa o pipetta
INGLOBAMENTO
O INCLUSIONE
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INCUBAZIONE DEI MICRORGANISMI
I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una
TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per
permettere la crescita del microrganismo con cui si sta lavorando
Esempi:
Geobacillus stearothermophilus
G+, anaerobio facoltativo, termofilo
Incubazione a 60°C per 8-12 h
Bifidobacterium bifidum
G+, anaerobio stretto, mesofilo
Incubazione a 37°C per 36-48 h
Giara di
anaerobiosi
Agitatore
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Gas-pak per l'allevamento colturale di batteri anaerobi: si
notino la giara a chiusura ermetica, la busta generatrice di
anaerobiosi e la cartina indicatrice di anaerobiosi
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Determinazione della carica microbica
MISURAZIONE DIRETTA
CONTA TOTALE AL
MICROSCOPIO
(con camere di conta)
CONTA VITALE
(piastramento di
diluizioni seriali)
MISURAZIONE INDIRETTA
Misura della torbidità
(spettrofotometro)
Misura della conducibilità
(conduttimetro)
Misura della variazione di pH (per es. per un batterio
lattico che cresce con metabolismo fermentativo
producendo acido lattico)
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DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA CARICA
MICROBICA TOTALE
Conta diretta con microscopio delle cellule contenute in un volume noto di campione, attraverso
l’impiego di CAMERE DI CONTA (camera di Thoma o di Burker o Neubauer)
In queste camere il vetrino portaoggetto è inciso in superficie con un reticolo
quadrettato di cui è nota l’area di ogni riquadro
Dato che lo spessore tra il
reticolo
ed
il
vetrino
coprioggetto è noto, è
possibile determinare il
volume di sospensione
batterica contenuta in ogni
riquadro
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La sospensione cellulare
è aggiunta qui. Lo spazio
tra il vetrino portaoggetto
ed il coprioggetto è noto
Osservazione
microscopica e
conta delle cellule
Calcolo del nr di
cellule per ml
LIMITI: - impossibile distinguere le cellule morte dalle vive;
- difficoltà di conta di cellule mobili o molto piccole, come molti batteri;
- inadeguato per campioni a densità cellulare bassa (circa <106) (a
meno di concentrare il campione )
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Determinazione della carica microbica VITALE
DILUIZIONI SERIALI DECIMALI
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
soluzione fisiologica
o una soluzione
tampone adatta a
preservare la
sopravvivenza dei
microrganismi
Campione
da
analizzare
9 ml
Diluizione
9 ml
9 ml
9 ml
1:10
1:100
1:1000
10-1
10-2
10-3
9 ml
9 ml
1:10000
1:100000
1:1000000
10-4
10-5
10-6
Semina per
spatolamento
(0,1 ml)
*
NON CONTABILI
159
159 x 103 = 1,59
Fattore di
diluizione
2
0
colonie
colonie
*, le colonie sono visibili
x 105 ufc / ml ESCLUSIVAMENTE
DOPO INCUBAZIONE
Unità Formanti Colonia delle piastre all’adeguata
temperatura
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colonie
Semina per inglobamento
o inclusione (1 ml)
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colonie
Determinazione della carica microbica VITALE
attraverso il piastramento di diluizioni seriali
Permette di ottenere i migliori risultati possibili circa il numero di cellule vitali in un campione
ed è perciò ampiamente utilizzata
Permette di contare solo le cellule vive, dove per viva si intende una cellula capace di
dividersi e di dare origine a una progenie
È adatta ad individuare anche un numero molto ridotto di cellule in un campione
Con l’uso di opportune condizioni o opportuni terreni selettivi è possibile ottenere la conta
vitale di specifici gruppi microbici
Talvolta non è facile trovare condizioni di crescita (terreno, temperatura, tempo di
incubazione) adatti a tutti i microrganismi di un campione microbiologicamente complesso.
Inoltre, certi microrganismi crescono più rapidamente di altri
Questa tecnica si basa sul PRESUPPOSTO che ogni colonia sia originata da una
singola cellula vitale. Sorgono pertanto problemi per cellule legate fra loro, ad
esempio in catenelle come gli streptococchi. Per questo, il risultato di questo
analisi di conta microbica non è indicato come numero di cellule, ma come UNITÀ
FORMANTI COLONIA (UFC) per unità di peso o di volume
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