Isolamento - AgrariaFree

Esercitazione di microbiologia generale
Isolamento
Per conoscere le le proprietà di specie di
microrganismi che convivono nel medesimo
ambiente dovremo riuscire a:
Letteralmentesepararli
separarlifisicamente
fisicamentegligliuni
unidagli
daglialtri;
altri;
1.1. Letteralmente
Farlicrescere
crescere separati
separati ininlaboratorio
2.2. Farli
laboratorio in condizioni
artificiali.
Operazioni fondamentali dell’indagine microbiologica
ISOLAMENTO E COLTIVAZIONE
Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula)
dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule)
con cui convive.
Coltivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) su
un substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine una
popolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie.
Coltura pura o axenica
Coltura o popolazione cellulare derivante dalla moltiplicazione di una
singola cellula microbica
TECNICHE DI SEMINA E
ISOLAMENTO
Presupposto fondamentale per lo studio e
l’identificazione dei m.o., isolati dai vari materiali
sottoposti all’esame microbiologico, è quello di
disporre di una coltura pura
Per coltura pura si intende
l’insieme delle cellule che si
ottengono dalla riproduzione di
una sola cellula iniziale
TECNICHE DI ISOLAMENTO
Per ottenere una coltura pura è quindi necessario :
•diluire il campione iniziale per separare le cellule
presenti (isolamento)
•trasferire una singola colonia in un terreno sterile in
modo da ottenere una popolazione di cellule identiche
(coltura pura)
TECNICHE DI ISOLAMENTO
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA
ISOLAMENTO
PER
MONOCITOGENETICA
COLTURA
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO
• E’ necessario un terreno agarizzato su piastra Petri
•Si depone sul terreno una piccola quantità del campione
da analizzare (popolazione mista)
•Con l’ansa si striscia il campione su tutta la piastra
•Il sistema può variare in relazione al percorso da far
seguire all’ansa sulla superficie dell’agar
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO 1
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO 2
ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO
Le cellule vengono rilasciate in maniera disuguale:
• le « strisciate » iniziali rilasceranno molte cellule che daranno
origine, dopo incubazione, ad una patina
•Il progressivo esaurimento del carico dell’ansa determinerà
alla fine la semina di poche cellule separate tra loro.
Terreni di coltura
Tecniche di semina per isolamento
Semina per isolamento
Terreni di coltura
Tecniche di semina per isolamento
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA
•È necessario preparare una serie di provette
contenenti acqua sterile, soluzione salina o terreno
liquido
•Il campione viene inoculato in modo tale che
ciascuna provetta riceva una certa quantità della
sospensione cellulare della provetta precedente
•In questo modo ciascuna provetta rappresenta
una determinata diluizione del campione iniziale
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE
SUCCESSIVA
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Campione
iniziale
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
Diluizione
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
ISOLAMENTO PER DILUIZIONE
SUCCESSIVA
Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione
viene depositata su terreno agarizzato già solidificato
Con una bacchetta di vetro si spande il campione su
tutta la piastra
A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno
separate le une dalle altre
ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO E
PER DISSEMINAZIONE
DILUIZIONI
10-1
10-2
10-3
10-4
SEMINA E ISOLAMENTO PER
INCLUSIONE
Piastramento per inclusione: un volume noto di coltura viene
pipettato su una piastra Petri sterile, viene poi aggiunto il
terreno agarizzato ancora fuso ma non troppo caldo (45-48 °C).
Il terreno viene mescolato alla coltura. Viene utilizzato per lo
sviluppo di mo anaerobi
ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO
Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione
viene depositata su terreno agarizzato già solidificato
Con una bacchetta di vetro si spande il campione
su tutta la piastra
A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno
separate le une dalle altre
Isolamento per coltura monocitogenetica
Questo tipo di isolamento permette di poter catturare una
cellula dalla piastra di coltura mediante l’utilizzo di un ago
capillare. In questo modo si ha l’assoluta certezza di aver
isolato una singola cellula
abcd
1
2
3
4
micromanipolatore
Capillare con il quale vengono
posizionate le cellule
sulla piastra (ingrandimento)
Posizionamento delle
cellule su terreno completo.
Le cellule sono posizionate
a quattro a quattro. I numeri
e le lettere indicano
La posizione di ogni cellula
ID dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie
Forma
puntiforme
Rilievo
d < 1 mm
circolare
filamentos
a
rizoide
irregolare
(1 di 2)
effuso
piatto
irregolare, a filo
intrecciato
irregolare, ramificata
sopraelevato
convesso
umbonato
sottile, allungato
ID dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie
Superficie
Margine
intero
liscia
rilevata
ondulata
radiata
concentrica
rugosa
ondulato
eroso
anelli concentrici
filamentoso
raggrinzita
arricciato
(2 di 2)
ID dei microrganismi
Caratteristiche biochimiche
– Capacità di utilizzare determinati substrati
come unica fonte di carbonio
– Presenza di particolari enzimi
– Produzione di specifici prodotti metabolici
terminali
– Capacità di fermentare particolari zuccheri