La natura chimica del DNA

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CORSO DIPi GENETICA
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LA NATURA
CHIMICA
DEL
DNA
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Le leggi di Mendel (1865)
”
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B
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• r
Legge della
dominanza e della
“
e recessività
i
P ino
o • rLegge
della segregazione o
b
t
r
disgiunzione
U
e
i
b
• Legge dell’indipendenza dei
d
o
R tà
caratteri
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s
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v
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Eredità particolata
n
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Lo Streptococcus pneumoniae
”
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Questo B batterio
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t provoca
l
n
la polmonite
r
e
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nei
mammiferi.
C
r
“
e o L’esito è letale per
i
P in animali di piccole
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t
dimensioni (per es.
r
U
e
nei topi). Nell’uomo,
i
b
d
o
dopo la scoperta
R tà
degli antibiotici, non
i
s
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è più letale.
e
v
i
n
U
Anche i batteri hanno un fenotipo
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L’esperimento di Griffith (1928)
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L’esperimento di Griffith (1928)
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L’esperimento di Griffith (1928)
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L’esperimento di Griffith (1928)
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Conclusioni
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Esiste un fattorer trasformante
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P
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che può passare
da
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ceppo
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t
r Ual calore) ad un
(anche se eucciso
i
b
d
così in
ceppo RRo e trasformarlo
à
t
i
s
un cepporS.
e
v
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n
U
Qual è il fattore trasformante?
•
•
•
•
•
•
La composizione chimica
”
degli esseri viventi
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B
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Acqua
n
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Sali minerali
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P ino
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Polisaccaridi to
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Lipidi
d
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R tà
Proteine si
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v
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Acidi nucleici
(DNA ed RNA)
n
U
Qual è la molecola che trasporta l’informazione genetica?
Avery, MacLeod & McCarty (1944)
”
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s
r
e
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n
DNAU è
il
responsabile
della
trasmissione
Il
dell’informazione genetica (ma molti non ci credettero!).
Il principio trasformante è il DNA
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RNA
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Hershey & Chase (1952)
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Il
sistema
del
batteriofago serie
T (foto: un T2)
evita contaminanti:
ci sono solo DNA e
proteine!
”
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Il ciclo vitale di un fago
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Marcatura specifica
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del DNAtili o Bo
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Marcatura specifica
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delle proteine
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Risultati (1)
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Risultati (2)
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La composizione del DNA ”- 1
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La
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composizione
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del DNA - 2 ier o “
P
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Le basi azotate sono
r
U
e
collegate tra loro tramite
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b
d
o à
ponti molecolari R
costituiti
t
da uno zucchero pentoso
i
s
e da un acido fosforico,
r
e
sia nel DNA cheiv
nell’RNA.
n
U
I dati di Chargaff e Davidson
(1949)
”
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Le osservazioni di Chargaff e Davidson
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P ino
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b
¸ La quantità di pirimidine
(T+C)
è sempre uguale alla quantità di
d
o
purine (A+G);
R tà
i
s è sempre uguale a quella di Timina e la
¸ la quantità di Adenina
r
e
quantità di Guanina
è sempre uguale a quella di Citosina;
v
i
n
¸ ma la quantità
U di A+T non è necessariamente uguale a G+C;
questo rapporto varia nei vari organismi!
I dati di
”
o
Wilkins
e
i
B
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n
ge CaFranklin
r
“
e
i
P ino Wilkins e Franklin,
o rb
tramite studi con la
t
r
U
e
diffrazione a raggi X,
i
b
d
o
determinarono che il
R tà
DNA è una molecola
i
s
lunga
e
sottile,
r
e
elicoidale, composta
v
i
n
da due parti simili tra
U
loro e parallele.
Watson & Crick (1953)
”
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r
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R tà
i
s
r
e
Erwin Chargaff,
v
i
n
oral history interview,
U
American Philosophical
"Crick and Watson are very
different. Watson is now a very
able, effective administrator.
In that respect he represents
the American entrepreneurial
type very well. Crick is very
different:
brighter
than
Watson, but he talks a lot, and
so he talks a lot of nonsense.”
http://osulibrary.orst.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/
Society, Spring, 1972.
Le basi azotate
formano legami
idrogeno
i
B
l
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e Ca
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“
e
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P
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Questo perché sugli atomi di oO
b
t
r
ed N si forma una parziale carica
r
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negativa
(atomi
fortemente
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b
d
o
elettronegativi rispetto
R a tCà ed
H) mentre su H si forma
una
i
s Se gli
r
parziale carica positiva.
e
v
atomi vengono a i trovarsi alla
n
distanza giusta,
le cariche
U
opposte cominciano ad interagire.
”
o
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o
i
B
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e Ca
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“
e
i
P inIo legami tra
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r
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i
b
basi azotate,
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o
R tà
i
s
zucchero e
r
e
v
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n
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fosforico
Organizzazione strutturale del
DNA
”
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n
Il DNA è una
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doppia relica
“
e
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costituita
P daidue
n
o catene
b
t
r
r
polinucleotidiche
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e
i
b
avvolte
a spirale
d
o
R tàe antiparallele.
i
s
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3’ 5’
e
v
i
n
U
5’
3’
Solco maggiore e solco minore
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Altre strutture del DNA
i
B
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La grande flessibilità degli
t rlo
n
atomi attorno ai legami covalenti
e Ca
g
r
permette al DNA di assumere
“
e
o
forme molteplici secondo le Pi
n
i
o rb
“circostanze ambientali”.
t
r
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s
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Altre strutture del DNA
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”
o
Come si duplica il DNA?
”
o
i
B
l
i
o
t e Crick,
l
Come accennarono nel loro lavoro Watson
la struttura
n
r
e la suaCtrasmissione
a
stessa del DNA suggeriva come avveniva
da una
g
r
“
e
generazione all’altra. Grazie alla
complementarietà
delle basi
i
o
P iqueste
n
azotate nel formare legami idrogeno,
potevano in qualche
o
t DNArbindicando la sequenza con cui
modo dirigere la sintesi dirnuovo
U
e
aggiungere le basi della doppia
elica
neoformata.
i
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s
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v
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n
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Tuttavia esistono vari modi per raggiungere tale scopo…
La replicazione del DNA
”
o
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B
l
IPOTESI 1: REPLICAZIONE CONSERVATIVA
i
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r
“
e
i
P ino
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Doppia elica di t
DNA
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parentale
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o
R tà
i
s
r
e
v
Molecole
i di DNA dopo
n
Uciclo replicativo
un
La replicazione del DNA
”
o
i
B
l
IPOTESI 2: REPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
Doppia elica di t
DNA
r
parentale
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i
s
r
e
v
Molecole
i di DNA dopo
n
Uciclo replicativo
un
La replicazione del DNA
”
o
i
B
l
IPOTESI 3: REPLICAZIONEi DISPERSIVA
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
Doppia elica di t
DNA
r
parentale
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b
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o
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s
r
e
v
Molecole
i di DNA dopo
n
Uciclo replicativo
un
Meselson e Stahl (1958)
Grazie a quanto illustrato precedentemente, è
possibile analizzare il comportamento del DNA
attraverso
vari
cicli
di
replicazione.
Come
differenziare però il DNA? Meselson e Stahl idearono
un sistema in vivo costruito in questo modo: fecero
crescere E. coli in presenza di 15N (isotopo pesante
del normale 14N atmosferico) per n generazioni, in
modo che tutto il DNA del batterio incorporasse 15N.
Questo DNA pesante corre in modo diverso in un
gradiente di cloruro di cesio, e forma una banda di
altezza diversa rispetto al DNA “normale” (14N), in
corrispondenza
del
suo
punto
isostatico
(galleggiamento). Analogamente, il DNA misto correrà
in modo diverso da quello tutto pesante o tutto
leggero, permettendo quindi di capire cosa è avvenuto.
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CsCl
concentrazione
crescente
Tutti i modelli permettono di fare
previsioni su più cicli replicativi
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I risultati ottenuti o”
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Il DNA
Usi replica in maniera SEMICONSERVATIVA!
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in vitro e in vivo
”
o
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B
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e Ca
g
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I risultati di Meselson e Stahl
erano “stati ottenuti su
e
i
o
batteri tenuti forzatamente
per molte
P in inpresenza,
o Bisognava
b
generazioni, di azoto pesante.
ancora dimostrare:
t
r
r
U
e
i
b
• che un sistema meno
invasivo
dava gli stessi risultati;
d
o
R semiconservativa
à
• che la replicazione
è valida anche per gli
t
i
eucarioti.
s
r
e
v
i
n
U
Taylor (1958)
i
B
l
i
o
t
l
n
r
Taylor dimostrò negli
e
a
g “C
eucarioti
che
la
r
e o
i
replicazione del DNA
P
n
i
è semiconservativa.
o rb
t
Egli usò gli apici
r
U
e
radicali delle piante b
i
d
o
(in attiva divisione),
R tà
i
sincronizzò le cellule
s
r
tramite colchicina e
e
v
le colorò con i Hn
timidina, rivelata
U poi
3
per autoradiografia.
”
o
Gli esperimenti
di Taylor,
Woods e Hughes
i
B
l
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t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
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P ino
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r
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Taylor (1958)
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”
o
L’uso della BrdU
i
B
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P ino
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R tà
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s
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i
n
U
Lo stesso risultato si
può
ottenere
anche
tramite
colorazioni
alternative del DNA,
come per esempio con la
Bromo-deossi
Uridina
(BrdU). Questo “analogo
di base” può sostituire
nel DNA la timidina,
fluoresce in maniera
diversa e/o può essere
rilevato con anticorpi
specifici.
”
o
Risultato citologico con BrdU
(cromosomi arlecchino)
”
o
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
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d
o
R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
Tra l’altro, i cromosomi arlecchino forniscono la prova
citologica del crossing over mitotico!