Nella mutagenesi a cassetta una breve sequenza sintetica di DNA

Nella mutagenesi a cassetta una breve sequenza sintetica di DNA, contenente la
mutazione desiderata, viene inserita nel gene bersaglio al posto della
corrispondente regione wild-type. Vantaggi: facile e di semplice esecuzione,
efficienza mut.100%. Svantaggi: necessità di siti di restrizione unici ai lati della
regione che si intende mutagenizzare e un numero limitato di oligonucleotidi
sintetici di sostituzione
Il problema si risolve come sopra usando particolari oligonucleotidi modificati: durante la
sintesi del filamento superiore dell’oligonucleotide, nelle posizioni indicate con la lettera N
viene utilizzata una miscela di tutti e quattro i nucleotidi. Per la sintesi del filamento inferiore,
nelle posizioni corrispondenti viene inserito un nucleotide contenente la base inosina (I).
L’oligonucleotide a doppio filamento viene poi inserito nel sito appropriato del vettore di
clonaggio
Mutagenesi mediata da
oligonucleotidi: il
frammento di Klenow
della DNA polimerasi è
stato successivamente
sostituito dalla DNA
polimerasi di T7
Utilizzo della mutagenesi mediata da oligonucleotidi per la generazione di mutazioni multiple,
di delezioni e di inserzioni
Phage-Display
• Nella tecnica del phage-display un
segmento di DNA viene inserito all’interno
di un fago in modo da venire espresso come
proteina di fusione con una delle proteine
del capside. Questa metodica è efficace e
permette di ingegnerizzare e selezionare
piccoli peptidi dotati di funzioni specifiche.
Phage display.. continua
• E.coli trasformato con il DNA ricombinante,
produce particelle fagiche che espongono sulla
superficie gli aminoacidi codificati dalla sequenza
aggiunta. I fagi contenenti motivi peptidici
particolari (es. siti di legame per anticorpi)
vengono isolati mediante cromatografia per
affinità. Con questo approccio sono stati analizzati
milioni di peptidi a sequenza casuale per verificare
la loro capacità di legare un particolare anticorpo,
ad es.