Attività "BIOLAB" classe II C

Chi è il colpevole?
Sperimenta il “BioLab”
La 2 C dell’ITC VERRI all’Istituto di Biotecnologie di via Golgi 19
Milano, 10 marzo 2005
La 2 C al completo…o quasi
Qualche premessa…
Studiare il DNA sui libri può essere un po’
pesante, ma soprattutto non fa comprendere
esattamente cosa si fa in un laboratorio di genetica
molecolare quando si analizza, per le più diverse
ragioni, questa molecola di cui tanto si parla negli
ultimi tempi, ma non si conosce abbastanza. Per
questo motivo, con la professoressa Oliva, siamo
andati in Università dove, nel laboratorio di
Biotecnologie abbiamo svolto un esperimento
intitolato
“Chi è il colpevole?”
Struttura DNA
Il DNA è un polimero di unità più piccole legate tra loro attraverso legami fosfo-diesterici: i
nucleotidi.
Abbiamo 4 diversi tipi di nucleotidi, che si differenziano per la base azotata che contengono.
Infatti un nucleotide è costituito da uno zucchero (il deossiribosio nel DNA o il ribosio nell'RNA),
un gruppo fosfato, ed una base azotata (citosina, adenina, timina, uracile, guanina).
La struttura del DNA è stata scoperta nel 1953 da Watson & Crick: il doppio filamento è costituito
da due filamenti anti paralleli (e quindi con direzioni opposte, 5'-3' e 3'-5'), attorno ad un asse
centrale. In funzione della composizione del filamento dell'idratazione, abbiamo diverse forme. A
causa di proteine dette istoniche che si associano con il DNA, il filamento si organizza in
nucleosomi, e queste si strutturano in polinucleosomi. Essi poi si condensano ulteriormente in
nucleofilamenti, che si associano in anse su una struttura polisaccaridica, detta scaffold, che
costituisce proprio lo scheletro del cromosoma.
Replicazione del DNA
Durante la duplicazione del DNA, il doppio filamento è separato attraverso una elicasi. Ogni
filamento di DNA serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento, prodotto grazie alla DNA
polimerasi. Il processo di duplicazione del DNA è detto Replicazione.
Durante la replicazione del DNA la direzione di sintesi è da 5' a 3'. Poichè il DNA ha due filamenti
antiparalleli, un filamento (detto leading) viene sintetizzato continuamente, l'altro (detto lagging) in
modo discontinuo, con la formazione dei frammenti di Okazaki (corte catene di RNA che servono per
far procedere al contrario la DNA polimerasi per piccoli tratti).
Le cellule viventi usano la replicazione del DNA per la trasmissione e duplicazione dell'informazione
genetica alla loro generazione
Trascrizione
In cellule animali e vegetali l'informazione genetica è portata da molecole di DNA,
nel nucleo, attraverso molecole di RNA, nel citoplasma. Il processo è catalizzato da
RNA polimerasi ed il processo chiamato Trascrizione.
Per esempio una sequenza di DNA come 3’-ACGCGCGCGATAATG-5’, siccome nella
trascrizione la A è tradotta in U, la T in A e G in C, la sequenza corrispondente in
RNA è 5’-UGCGCGCGCUAUUAC-3’.
Negli organismi eucarioti tre differenti RNA polimerasi catalizzano la sintesi di tre
diversi tipi di RNA. Nei procarioti, invece, c’è un solo enzima che lo fa.
La trascrizione è il primo passo per la traduzione e sintesi proteica. Da recenti
scoperte sembra avere però anche un ruolo in una regolazione dell'espressione,
grazie ad un fenomeno detto Interferenza.
La tecnica della PCR
(polymerase chain reaction)
inventata da Kary Mullis nel 1985
(premio Nobel per la chimica nel
1993) ha rivoluzionato la genetica
molecolare. Essa offre la possibilità di
produrre un enorme numero di copie
di una sequenza specifica di DNA
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
La PCR è una tecnica che prevede l’amplificazione di una sequenza di DNA di cui si
conoscono gli estremi.
Per realizzarla si ha bisogno di:
- Sequenza da amplificare
- NTP (nucleoclosidi tri fosfati, come ATP, CTP, GTP, TTP)
- Primer (Sequenze complementari agli estremi della sequenza da
amplificare)
- TAQ (una polimerasi estratta da un batterio termofilo, in grado di non
denaturarsi ad alte temperature)
- Buffer (i tamponi necessari per la reazione di elongazione)
La PCR avviene in una serie di cicli composti da tre fasi:
- nella prima abbiamo la separazione dei frammenti, fase che avviene ad alte
temperature (denaturazione)
- una fase di Annealing, appaiamento, in cui i primer si appaiono a filamenti
- a fase in cui la TAQ polimerasi sfruttando il gruppo (OH)- libero fornito dai primer,
polimerizza usando come stampo la sequenza (extension)
PCR
Nel primo ciclo si ha una duplicazione dal primer fino alla fine del frammento, ma nei
cicli successivi si ha la amplificazione della sola sequenza compresa tra i due primers.
La PCR in realtà prevede numerose varianti, che permettono di far aggiungere delle
“ali” negli estremi della sequenza. Oppure è usata per far aggiungere delle mutazioni
nella sequenza (perché magari una sequenza genica).
In laboratorio
…qualche ulteriore spiegazione…
Gli strumenti di lavoro…
Le prove di “manualità”
Le nostre “dottoresse”
…e i nostri “dottori”…
Prepariamo il gel di agarosio per
l’elettroforesi
Elettroforesi
Tecnica che permette di separare frammenti di acido nucleico, in funzione del peso molecolare.
Frammenti di DNA, carichi negativamente per i residui di fosfato, in un campo elettrico tendono ad andare verso il
polo positivo. Usando una griglia molecolare costituita da agarosio (o acrilammide se si vuole ottenere una
maggiore risoluzione -usata nel sequenziamento-) lasciato polimerizzare (l'agarosio si scioglie in acqua con
temperature sopra i 70°C, raffreddandosi polimerizza), i frammenti passano attraverso di essa. Più sono grandi e
pesanti e più fanno fatica restando indietro rispetto a frammenti più piccoli che passano più velocemnte tra le
maglie.
La visualizzazione è garantita da sostanza intercalanti, come l'etidio di bromuro, che sono fluorescenti se esposte ai
raggi UV. L'uso di un ladder (una serie di frammenti a dimensione nota), permette per confronto di avere
informazioni sulle dimensioni dei frammenti.
L'elettroforesi è una tecnica che si applica sia con DNA che con RNA, sia a singolo che doppio filamento.
Variando la concentrazione di agarosio si ottengono maglie più o meno fitte, da usare in funzione della dimensione
del frammento (più è piccolo e più migra velocemente) e se si tratta di un frammento ds o ss.
Tutti all’opera…
Il gel è pronto, bisogna caricare i
“pozzetti” per l’elettroforesi…
…la fase più delicata…prelevare i
campioni di DNA…
…e caricare i pozzetti per
l’elettroforesi…
…ora aspettiamo i risultati della
“corsa elettroforetica”…
Un po’ di considerazioni teoriche…
Il termine polimorfismo significa “esistenza di forme diverse”. In genetica, il
polimorfismo può essere analizzato a livello di proteina (polimorfismo proteico)
oppure di materiale genetico (polimorfismo genetico). In questo secondo caso,
le forme diverse (ossia le varianti genetiche) possono riguardare un gene,
vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina, oppure un tratto di DNA
non codificante. Nel primo caso, si parla di polimorfismo allelico, nel secondo
caso di polimorfismo del DNA. Per polimorfismi allelici si intende l’esistenza di
due o più alleli diversi di uno stesso gene o locus. Gli alleli di un gene si
formano uno dall’altro per mutazione, ossia per variazione della sequenza
nucleotidica di un gene. Gli alleli di un gene possono essere identificati a
livello fenotipico, perché possono determinare fenotipi diversi, ad esempio
capelli neri o biondi. Se gli alleli di un gene sono due, il polimorfismo si
chiama polimorfismo biallelico. Se gli alleli sono in numero maggiore di due
(come nel sistema di gruppo sanguigno ABO), il polimorfismo è detto
polimorfismo multiallelico.
Quali sequenze di DNA si analizzano..
Polimorfismi di sequenza (microsatelliti)
Nel caso dei polimorfismi del DNA, contrariamente ai polimorfismi
allelici, la variazione di sequenza nucleotidica avviene in
genere in un tratto di DNA non codificante, che nel suo
complesso costituisce circa il 98% del genoma. I polimorfismi
del DNA sono quindi più frequenti dei polimorfismi allelici e
conseguentemente più utili nella ricerca genetica. E’ stato
osservato che il DNA di due individui differisce per circa un
nucleotide ogni 500/1000. Poiché interessano generalmente il
DNA non codificante, i polimorfismi del DNA rappresentano
differenze tra individui, senza conseguenze sul fenotipo.
Quindi, non è possibile rilevarli osservando le caratteristiche
fenotipiche di un individuo. Esistono diversi tipi di polimorfismi
del DNA:
1.
polimorfismi di singoli nucleotidi = SNP (single nucleotide polymorphism)
2.
polimorfismi di ripetizione = VNTR (V= variable, N= Number, T= Tandem,
R= Repeats)
3.
polimorfismi di restrizione
Il DNA profiling
E’ una nuova tecnica di genetica molecolare, utilizzata in tutti
quei casi in cui è necessario effettuare l’identificazione di un
individuo. Oltre che nei laboratori di ricerca in genetica
molecolare, questa tecnica è usata nei laboratori di medicina
legale di tutto il mondo. Il DNA profiling può essere applicato
all’identificazione di materiale per attribuirne l’appartenenza a
vittime o sospetti, come succede nei casi di incidenti aerei,
delitti, stupri. Il test del DNA può essere applicato anche alla
determinazione di relazioni familiari come paternità, nascite
conseguenti a stupri o incesti. Un vantaggio di questa tecnica è
che essa consente di analizzare il DNA di un individuo, partendo
da quantità molto piccole di materiale biologico. E’ sufficiente
una piccola quantità di cellule, come un capello o le tracce di
saliva su un bicchiere o su una sigaretta per poter effettuare il
test del DNA con la PCR. Il test del DNA si basa sull’analisi dei
microsatelliti dopo estrazione del DNA dal campione in esame,
amplificazione delle sequenze di DNA relative ai microsatelliti
(tramite PCR) ed elettroforesi.
La storia della nostra “indagine”
Antefatto
Gianni, un ragazzo di quindici anni, vince una gara di bicicletta e
tornando a casa si imbatte in un gruppo di teppisti che vogliono
rubargli il trofeo e la bici. Dopo una colluttazione conclusasi con il
furto del trofeo al vincitore e la fuga dei teppisti, arriva il vigile di
quartiere che soccorre il malcapitato e lo riaccompagna a casa. I
genitori decidono di denunciare il fatto alla polizia e dopo accurate
ricerche vengono rintracciati alcuni ragazzi, presenti durante la gara
e rientrati a casa con evidenti e sospette ferite. Anche la bicicletta di
Gianni è macchiata di sangue, così come i suoi vestiti. La polizia
scientifica inizia l’analisi del materiale biologico e decide di
identificare il colpevole, facendo il profilo del DNA.
I campioni utilizzati
Schema dell’esperimento
 Il campione di materiale biologico di Gianni è
indicato con V= vittima
 Il campione prelevato sulla scena del crimine è il
sangue ritrovato sulla bicicletta ed è indicato con la
lettera SC
 I campioni prelevati dai sospettati sono indicati con:
S1, S2, S3
 Dai campioni viene estratto il DNA, viene poi
applicata la tecnica della PCR, utilizzando coppie di
primer specifiche per i tre diversi microsatelliti;
successivamente si effettua l’elettroforesi e si
analizzano i risultati.
Ci siamo impegnati molto…
…e siamo soddisfatti del nostro
lavoro…
I risultati
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Per capire…
Micr.1
Micr.2
Micr.3
Come si interpretano i risultati
La foto del gel va osservata attentamente per stabilire
quale indiziato ha lo stesso profilo del DNA di quello
prelevato dalla scena del crimine. Per avere la certezza
è necessario che le bande dell’indiziato coincidano tutte
perfettamente con quelle del campione trovato, ossia
presentino lo stesso profilo di DNA. Nel nostro caso
questo accade per l’indiziato 2. Attenzione: in genetica,
una rondine non fa primavera, ma neanche due! In altri
termini, per poter fare il profilo di un individuo ed
ottenere risultati attendibili, bisogna analizzare secondo
l’FBI almeno 13 microsatelliti. Nel nostro esperimento,
abbiamo analizzato 3 microsatelliti e non 13, per motivi
di tempo, di spazio e di costi.
Qualche ringraziamento
Questa esperienza è stata possibile grazie
all’aiuto e alla competenza di tutto il gruppo
di lavoro di “Sperimenta il Biolab”
dell’Università degli Studi di Milano, e, in
particolare, della professoressa Cinzia
Grazioli che tutti gli studenti della 2 C
ringraziano per la disponibilità e gentilezza.