Estrazione acidi nucleici con particolare riferimento a DNA estratto

ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON
PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA
ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN
FORMALINA E INCLUSI IN
PARAFFINA (FFPE)
SALVATORE GIRLANDO
LABORATORIO PATOLOGIA MOLECOLARE
ANATOMIA PATOLOGICA
TRENTO
Estrazione acidi nucleici
• Estrazione DNA primo passo nelle applicazioni di biologia
molecolare
• Metodi si basano sul tipo di acido nucleico che si vuole estrarre
(DNA/RNA)
• Materiale di partenza ad esempio sangue o tessuti o altro materiale
• Risultato desiderato (quantità, purezza)
• Applicazione prevista post-estrazione ad esempio tipo di indagine
molecolare
Estrazione acidi nucleici
• DNA molecola molto lunga soggetta a frammentazioni
• Difficile estrarlo in forma intatta
• Frammenti di 50 – 100 kilobasi (kb) sono ottimi per effettuare tutte le
indagini di biologia molecolare
• Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) il
DNA si presenta molto degradato ed è consigliabile amplificare al
massimo frammenti di 300 bp
Estrazione degli acidi nucleici
• Può essere estratto da qualsiasi tessuto o cellula nucleata
• Da materiale fresco e/o congelato
•
Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina
•
Altro (sangue, plasma, capelli, frammenti di tessuti, ecc.)
Estrazione degli acidi nucleici
(DNA/RNA) da campioni fissati in
formalina e inclusi in paraffina (FFPE):
fasi
1.
Taglio 8-10 fette da biopsie, 2-3 da pezzo operatorio dello
spessore di 10 µm
2.
Sparaffinatura/digestione O.N. con tampone di lisi più proteinasi K
3.
Purificazione dell’acido nucleico (più metodi)
4.
Precipitazione DNA
5.
Valutazione quantitativa
6.
Conservazione
1. Taglio delle fette di tessuto
• Da pezzo operatorio: 3-4 fette spesse 10 µm in provetta o su vetrino
• Da biopsia: 7-8 fette sempre dello stesso spessore (10µm )
• Altri metodi prevedono lo scraping, direttamente da vetrino, di cellule
o fette di tessuto precedentemente colorate e utilizzati per diagnosi
cito o istologiche
Fase 2. Processo di Sparaffinatura
• Aggiungere 1 ml di xilene e mescolare per
10 minuti
• Centrifugare a 12000 rpm per 5 minuti
• Eliminare il surnatante facendo attenzione
al pellet
• Si ripete una seconda volta il passaggio
2. Processo di sparaffinatura
• Aggiungere 1 ml di Etanolo Assoluto
• Mescolare per 5 min
• Centrifugare a 12000 rpm per 2 min
• Eliminare l’Etanolo assoluto
attenzione a non toccare il pellet
facendo
• Fare asciugare i campioni e aggiungere il
tampone di lisi (TRIS-HCl 50 mM ph 8.3) e
proteinasi K (20 mg/ml)
3. Purificazione acidi nucleici
Metodo fenolo/cloroformio (miscela fenolo:cloroformio:
alcool isoamilico (25:24:1)
Metodo del salting out (precipitazione delle molecole
proteiche)
Kits commerciali (molto in uso), maggiore velocità di
estrazione
Purificazione Fenolo/Cloroformio
•
Inattivazione della proteinasi K ad alta temperatura
•
Purificazione con miscela fenolo: cloroformio: isoamil alcool (25:24:1)
•
Separa una componete organica inferiore contenete lipidi, proteine e
estratti cellulari
•
Fase acquosa superiore contenente gli acidi nucleici
•
Fase intermedia proteine denaturate e in parte dissolte dal fenolo
Precipitazione DNA
- Aggiunta etanolo assoluto (1 mL) e tampone ad alta forza ionica (50 µL)
(Na acetato 3 M pH 5.2)
- Precipitazione DNA (formazione gomitolo)
- Centrifugazione a velocità alta (12.000 rpm)
- Lavaggio pellet con etanolo 70 %(1 mL) per rimuovere sali in eccesso
- Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno
15 min a provetta aperta
- Il DNA precipitato e asciutto può essere conservato a -20°C.
Risospensione DNA precipitato
- Il DNA viene risospeso in H2O o nel tampone previsto
dalla metodica.
- Può essere conservato a +4°C per qualche settimana o a
- 80°C per molti anni (evitare i congelamenti e scongelamenti ripetuti
che danneggiano il DNA)
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Estrazione fenolo/cloroformio
• Precipitazione del DNA in etanolo assoluto e in presenza
di Sali ad alte concentrazioni (100 – 500 mM) per
eliminare i residui di Fenolo e cloroformio
• Eliminazione surnatante e successivo lavaggio con
EtOH
70% per eliminare i cationi
• Centrifugazione ed eliminazione dell’ETOH 70%
• Risospendere il pellet con buffer TE o con H2O
Purificazione con metodica salting-out
• Dopo inattivazione della proteinasi K mediante alta
temperatura vengono aggiunte 200µl di ammonio
acetato (sale) 4 M favorendo la precipitazione delle
proteine
• Campioni vengono vortexati e centrifugati ad alta
velocità per 3 min.
• Trasferimento del surnatante in altra provetta e aggiunta
di isopropanolo (600 ul)
Purificazione con metodica salting-out
• Centrifugazione ad alta velocità per 5 min.
• Pellet lavato con ETOH 70% e centrifugazione sempre
ad alta velocità per 1 min
• Eliminazione del surnatante
• DNA sciolto in 50 µl di TE o H2O
Estrazione con kit commerciale (Qiagen)
• QIAmp DNA mini kit
• QIAmp DNA FFPE kit (specifico per tessuti paraffinati)
• Accorciamento dei tempi di estrazione
• Minore resa in termini di concentrazione di DNA (solo se si usa
sistema automatizzato)
Purificazione DNA da tessuti FFPE
• Lasciare asciugare il pellet facendo
attenzione a non seccarlo
• Risospendere in 180 µl di buffer ATL
contenente detergenti più 20 µl di
proteinasi k
• Incubare a 56°C per almeno 3 ore o
fino a che il pellet non sia
completamente digerito
• Procedere con la fase di
purificazione
Purificazione DNA da tessuti FFPE
• Aggiungere 200 µl di buffer AL
contenente agenti caotropici e incubare
per 10 min a 70°C;
• Aggiungere 200 µl di ETOH ass.
• Trasferire il tutto in una colonnina con una
base di silice, centrifugare
• Fare lavaggi con due passaggi con buffer
AW1 e AW2 per lavare il DNA legati alla
membrana
• Eluire con 50 – 200 µl di buffer AE o H2O
MACRODISSEZIONE
Blocchetto paraffina
Ematossilina/eosina
Fetta in bianco
MICRODISSEZIONE
Biopsia bronchiale
colorazione EE
Dopo
microdissezione
MICRODISSEZIONE
Agoaspirato
polmonare citologico
Dopo
microdissezione
BAL > 50
tumor cells
Esperienza di Modena