Lavoro di diploma di Sammy Moro SSMT, 2005.

~ LAVORO DI DIPLOMA ~
Elettroforesi: frazioni β 1 e β 2, utilità in diagnostica
Laboratorio Cantonale Immunologia Clinica
Ospedale S.Giovanni
6500 Bellinzona
Responsabile: Dr. Franco Keller
Moro Sammy
III FLM
Scuola Superiore Medico Tecnica
Anno 2004 / 2005
1 Indice
1
Indice............................................................................................................................................2
2
Riassunto......................................................................................................................................3
3
Nomenclatura ...............................................................................................................................4
3.1
Misure di grandezza .............................................................................................................4
3.2
Abbreviazioni e sigle ...........................................................................................................4
4
Introduzione .................................................................................................................................5
4.1
Le proteine ...........................................................................................................................5
4.2
L’elettroforesi.......................................................................................................................5
4.3
Le frazioni elettroforetiche...................................................................................................6
4.4
Interpretazione dei tracciati elettroforetici...........................................................................6
4.5
Criteri di ricerca ...................................................................................................................7
4.6
Difficoltà di ricerca ..............................................................................................................7
5
Materiali e metodi ........................................................................................................................8
5.1
Conservazione dei campioni ................................................................................................8
5.2
Materiale d’analisi................................................................................................................8
5.3
Materiale di lavoro ...............................................................................................................8
5.4
Apparecchi utilizzati ............................................................................................................9
5.5
Principio del metodo ..........................................................................................................10
6
Risultati ......................................................................................................................................11
7
Discussione ................................................................................................................................13
8
Conclusioni ................................................................................................................................14
9
Ringraziamenti ...........................................................................................................................14
10
Bibliografia ............................................................................................................................14
11
Allegati...................................................................................................................................14
2 / 19
2 Riassunto
Nei più svariati campi dell’immunologia si presenta anche un interesse per quanto riguarda le
proteine presenti nel siero.
Grazie all’elettroforesi abbiamo la possibilità di rendere visibile già ad occhio nudo su di un
supporto le classi proteiche separate mediante un campo elettrico.
Queste classi proteiche si dividono attualmente in cinque frazioni principali, conosciute come:
albumina, α 1 , α 2 , β e γ.
Lo scopo di questo lavoro di diploma è documentare se separare ulteriori frazioni possa essere utile
o meno alla clinica identificando le singole sieroproteine presenti in una determinata frazione.
Nel caso di questo lavoro viene separata la banda β in β 1 e β 2 grazie ad un nuovo tipo di gel della
ditta SEBIA (rue Maximilien Robespierre 23, 92130 Issy-les-Moulineaux), per avere
un’identificazione più specifica delle proteine che fanno parte di questa frazione, che sono
principalmente transferrina, LDL (Low Density Lipoprotein) e complemento (C3c).
3 / 19
3 Nomenclatura
3.1 Misure di grandezza
g/l
%
grammi su litro
valore in percentuale
3.2 Abbreviazioni e sigle
LC-CIC
OSG
alb
α
β
γ
ELFO
MW
pI
TRF
C3c
LDL
TP
laboratorio centrale di chimica e immunologia clinica
ospedale S.Giovanni
albumina
alfa
beta
gamma
elettroforesi
Molecular Weight, peso molecolare
punto isoelettrico
transferrina
complemento
low density lipoprotein
proteine totali
4 / 19
4 Introduzione
4.1 Le proteine
Le proteine sono un ampio gruppo di composti organici, formati da una sequenza di molecole
chiamate amminoacidi, legate l'una all'altra da legami peptidici. Presenti in tutti gli organismi
viventi, le proteine sono gli elementi costitutivi predominanti delle cellule e sono indispensabili per
il loro funzionamento.
Da questa definizione possiamo dedurre che le proteine possiedono quindi grandezze diverse,
dovute principalmente alla loro struttura differente.
Grazie all’interpretazione della loro concentrazione serica possiamo dirigerci con facilità verso
alcune diagnosi possibili.
Al giorno d’oggi possediamo molti mezzi per determinare la quantità serica di proteine, ma tramite
elettroforesi si può avere un quadro completo della loro concentrazione.
4.2 L’elettroforesi
Per definizione da un qualsiasi dizionario, l’elettroforesi è un movimento di particelle
elettricamente cariche attraverso un gel, per effetto di un campo elettrico applicato mediante una
coppia di elettrodi. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo
se hanno carica negativa; nel primo caso il processo è detto cataforesi, nel secondo anaforesi.
Nel nostro caso, con il gel utilizzato per questo lavoro (HYDRAGEL β1 β2, SEBIA), avremo una
separazione seguente:
Figura 1: Suddivisione proteica dopo migrazione elettroforetica
5 / 19
L’ELFO è una tecnica che ha subito nel tempo una forte evoluzione, riducendo di molto le difficoltà
nell’esecuzione, contatti diretti con i sieri e pipettaggi che portano a errori. Il metodo della ditta
SEBIA è ormai diventato un metodo standard molto pratico da usare anche per chi si trova alle
prime armi.
4.3 Le frazioni elettroforetiche
Come già detto, le frazioni d’importanza clinica sono attualmente quattro. Ogni frazione, racchiude
una determinata “famiglia” di proteine, come riportato nella figura 2:
Figura 2: picchi con le varie sieroproteine di un tipico tracciato elettroforetico
4.4 Interpretazione dei tracciati elettroforetici
Dalla figura 1 si può dedurre che aumenti, diminuzioni o variazioni di una banda elettroforetica
piuttosto che di un’altra, aiutano il medico a dirigersi verso determinate diagnosi.
Per esempio: l’aumento della frazione gamma può orientare verso patologie quali tumori o reazioni
immuni. Aumento della frazione beta potrebbe invece dirigere il medico verso patologie croniche o
malattie autoimmuni.
Un aumento della frazione beta cosa significa esattamente?
Principalmente nella frazione beta sono presenti, come già specificato in precedenza, la transferrina,
il complemento e le lipoproteine LDL.
Da questo si può dedurre che separare ulteriormente la banda β permette di poter visualizzare
queste tre sieroproteine singolarmente. Questo nuovo tipo di gel ci permette proprio di separare con
più specificità la banda β.
6 / 19
4.5 Criteri di ricerca
Al fine di effettuare le analisi sono stati scelti pazienti con dei valori di β globulina esterni ai limiti
dei valori normali.
Per aver un ulteriore aiuto nell’interpretazione finale, di ogni campione è stato effettuato anche il
valore di complemento e transferrina al Nefelometro (Dade Behring Holding GmbH, Höchster
Strasse 70, 65835 Liederbach, Germany) e il valore di LDL all’Hitachi (Roche Diagnostic, F.
Hoffmann-La Roche Ltd, Diagnostics Division, Grenzacherstrasse 124, CH-4070 Basel).
Sono stati scelti ventiquattro campioni, di questi ne sono stati esclusi alcuni una volta effettuate le
analisi, per motivi che spiegheremo successivamente.
4.6 Difficoltà di ricerca
Nella ricerca di pazienti potenzialmente interessanti per ottenere dei risultati sono state riscontrate
difficoltà non indifferenti, questo dovuto a delle scelte: è stato deciso, dopo discussione, di
escludere dalla scelta pazienti oncologici, a parte due eccezioni, in quanto la patologia è già
conosciuta, quindi non c’è nessun interesse clinico a proseguire con ulteriori indagini.
Una volta effettuate tutte le analisi dei ventiquattro pazienti, sono ancora stati esclusi dei campioni,
non ritenuti significativi per il lavoro e questo ha ridotto ulteriormente il numero di pazienti utili
alla ricerca.
7 / 19
5 Materiali e metodi
5.1 Conservazione dei campioni
Tutti i campioni raccolti sono stati aliquotati e quindi conservati a -20°C fino all’esecuzione delle
analisi. Ogni campione è stato trattato allo stesso modo.
5.2 Materiale d’analisi
Per le analisi è stato usato unicamente siero, prelevato ogni settimana dai pazienti della routine del
laboratorio LC-CIC.
5.3 Materiale di lavoro
Per il materiale rimandiamo alle indicazioni della ditta SEBIA, metodo HYDRAGEL β1-β2,
presente negli allegati.
Come componenti, intesi come reagenti e materiali, si disponeva di:
•
•
•
•
•
•
gels di agarosio, pronti all’uso
strisce tamponate, pronte all’uso
diluente per la soluzione colorante, soluzione concentrata
colorante Amidoschwarz, soluzione concentrata
applicatori, pronti all’uso
cartine da filtro sottili
tutti questi componenti vengono forniti nel kit HYDRAGEL 30 β1-β2 della ditta SEBIA.
Particolarità:
il gel contiene agarosio in concentrazione 8 g/l, tampone Tris-barbital a pH 8.5 ± 0.1 ed additivi
necessari per ottimizzare l’analisi. 1 Il gel nuovo rispetto a quello tradizionale è meno concentrato e
le maglie meno fitte, in questo modo riesce a dividere con più specificità le bande β.
Non si sono dovute preparare diluizioni delle soluzioni in quanto sono utilizzate normalmente in
routine dal laboratorio LC-CIC, quindi sono già state trovate pronte all’uso.
8 / 19
5.4 Apparecchi utilizzati
•
Per la migrazione elettroforetica:
Figura 3: HYDRASYS LC, apparecchio per migrazione e colorazione elettroforetica, laboratorio LC-CIC
L’apparecchio HYDRASYS LC è fornito dalla ditta SEBIA, permette di effettuare elettroforesi e
colorazione del gel.
•
Per la lettura dei gels di elettroforesi:
Figura 4: HYRYS HIT, densitometro per lettura gel elettroforetici, laboratorio LC-CIC
L’apparecchio HYRYS HIT della ditta SEBIA permette di leggere i gel elettroforetici e crea un
grafico dove mostra le bande presenti. Inoltre grazie al suo software dà risultati quantitativi delle
varie frazioni e permette di creare ulteriori bande nel grafico.
9 / 19
•
Per la determinazione di LDL:
Figura 5: HITACHI Roche, laboratorio centrale OSG
Apparecchio usato per la routine di chimica clinica dal laboratorio centrale Ospedale OSG,
Bellinzona.
•
Per la determinazione di TRF e C3c
Figura 6 Nefelometro DADE Behring, laboratorio LC-CIC
Apparecchio usato per la routine di nefelometria dal laboratorio LC-CIC Ospedale OSG,
Bellinzona.
5.5 Principio del metodo
Tale tecnica è basata sul principio della elettroforesi zonale effettuata su un adatto mezzo di
supporto. L’agarosio è un versatile ed efficace mezzo di supporto.
L’elettroforesi si basa sul principio che ogni proteina in un miscuglio possiede, se poste in campo
elettrico, una propria velocità di migrazione diversa dalle altre. In questo modo è possibile separare
varie frazioni proteiche. La velocità di migrazione dipende dalla grandezza (MW), dalla forma
(struttura terziaria) e dalla carica di superficie. A pH 8.6 tutte le proteine seriche hanno una carica
negativa, il loro pI è inferiore e 8.6, e quindi migrano verso l’anodo (polo positivo). 2
10 / 19
6 Risultati
Una volta effettuate tutte le analisi sono stati riportati nella seguente tabella tutti i valori:
8 - 15 5.8 - 11
6 - 10 2 - 5
4-7
n°
reparto
β%
β g/l
1
PS
11.2
9.14
7.8
4.7
4.70
2
MED
13.9
8.70
9.8
6.0
3
CH
18.1
13.61
8.3
4
ONC
15.5
8.31
5
PS
12.6
6
PS
7
2-4
<2.60 2.00 - 3.60 0.9 - 1.8
62 - 82
LDL
TRF
C3c
TP
3.84
2.96
2.22
1.412
81.6
6.13
3.76
2.46
2.64
1.360
62.6
11.9
6.24
8.95
1.28
1.42
1.264
75.2
12.7
3.6
6.81
1.93
1.66
1.60
1.490
53.6
10.08
7.4
6.8
5.92
5.44
0.92
2.12
1.302
80.0
32.5
25.61
30.5
2.6
24.03
2.05
2.80
2.56
1.356
78.8
PS
18.1
15.49
9.6
8.9
8.22
7.62
2.84
1.84
1.588
85.6
8
NEFR
14.9
7.24
9.2
6.1
4.47
2.96
2.50
1.08
1.396
48.6
9
MED
18.5
12.43
9.5
10.4
6.38
6.99
1.32
0.92
1.516
67.2
10
MED
15.7
10.08
6.9
7.5
4.43
4.82
0.24
1.36
1.974
64.2
11
MED
15.2
11.04
10.0
7.0
7.26
5.08
3.42
2.98
1.600
72.6
12
MED
16.2
7.97
9.6
9.1
4.72
4.48
0.12
1.66
2.06
49.2
13
MED
16.0
10.53
9.1
8.3
5.99
5.46
0.84
1.28
1.468
65.8
14
PS
41.1
35.92
37.9
2.4
33.12
2.10
2.64
2.58
1.354
87.4
15
MED
15.5
10.6
10.4
7.00
7.11
4.79
2.48
2.20
1.230
68.4
16
PS
7.1
5.35
5.9
9.4
4.45
7.09
1.30
1.04
0.540
75.4
17
ONC
6.8
6.45
5.6
2.9
5.31
2.75
1.38
1.96
0.682
94.8
18
PS
7.5
7.29
6.7
2.4
6.51
2.33
0.64
1.58
1.058
97.2
19
PS
7.4
4.96
5.4
2.7
3.62
1.81
1.82
1.90
0.472
67.0
20
MED
15.6
10.92
9.00
7.4
6.30
5.18
3.22
1.58
1.842
70.0
21
PS
6.9
5.99
4.4
2.9
3.82
2.52
1.62
1.64
1.076
86.8
22
PS
17.7
14.90
11.4
7.5
9.60
6.31
4.46
2.50
1.538
84.2
23
MED
18
7.34
13.4
7.1
5.47
2.90
7.08
1.70
0.976
40.8
24
PS
18.4
12.29
10.8
7.8
7.21
5.21
2.20
1.56
1.748
66.8
β1% β2%
β 1 g/l β 2 g/l
X
X
X
X
Legenda:
Eccezione reparto
Valore alto
Valore basso
X Picco monoclonale
Figura 7: risultati ottenuti per effettuare la ricerca
11 / 19
I risultati ottenuti al densitometro HYRYS HIT (figura 4) appaiono nel seguente modo,
per il gel tradizionale che separa le cinque frazioni:
Albumina
α1
α2
β
γ
Figura 8: Elettroforesi delle proteine, cinque frazioni. Gel tradizionale.
Per il gel nuovo in grado di separare sei frazioni:
Si può notare nella figura 9
che appare un picco in più
rispetto alla figura 8, indicata
dalla freccia rossa, questo
perché il grafico della figura 9
è stato effettuato con il nuovo
gel HYDRAGEL β1-β2.
I grafici di ogni campione
sono presenti negli allegati.
Albumina
α1
α2
β1
β2
γ
Figura 9: Elettroforesi delle proteine, sei frazioni. Gel nuovo.
12 / 19
7 Discussione
Principalmente l'elettroforesi viene utilizzata nella routine d'ospedale per la ricerca di bande
monoclinali. Circa l'80% delle elettroforesi di routine vengono considerate negative, però anche se
negativo un tracciato può dare informazioni supplementari al medico, mostrando per esempio picchi
elevati. Per questo motivo può essere utile avere ulteriori informazioni con aumenti o diminuzioni
di picchi.
Nella banda β 1 è presente transferrina e LDL, mentre nella β 2 è presente complemento C3c.
Come già accennato, abbiamo riscontrato una notevole difficoltà nella raccolta dei campioni.
I campioni 6, 14, 16 e 21 sono stati esclusi immediatamente, in quanto esprimono un picco
monoclonale, quindi nessuna utilità per il lavoro.
Per poter confermare e quindi provare i risultati del nuovo gel HYDRAGEL β1-β2 sono state
effettuate, come già spiegato, le proteine che dovrebbero esser presenti in questa determinata banda,
quindi per β 1 transferrina e LDL e per β 2 il complemento C3c.
Non in tutti i campioni ciò che era visibile su gel rispecchiava esattamente le analisi effettuate,
questo si presume per determinati fattori quali degradazione delle proteine, precisione e sensibilità
nella lettura al densitometro con conseguente spostamento verso sinistra o destra dei limiti delle
curve date dalle frazioni.
Nei risultati finali si sono presentati campioni correlanti, campioni che non correlano con le analisi
effettuate e campioni correlanti solo in parte, qui di seguito sono riportati in sintesi questi risultati:
n°
1
2
3
4
5
7
8
9
10
11
12
13
15
17
18
19
20
22
23
24
4-7 2-4
β 1 g/l β 2 g/l
4.70 3.84
6.13 3.76
6.24 8.95
6.81 1.93
5.92 5.44
8.22 7.62
4.47 2.96
6.38 6.99
4.43 4.82
7.26 5.08
4.72 4.48
5.99 5.46
7.11 4.79
5.31 2.75
6.51 2.33
3.62 1.81
6.30 5.18
9.60 6.31
5.47 2.90
7.21 5.21
<2.60 2.00 - 3.60
LDL
TRF
2.96
2.22
2.46
2.64
1.28
1.42
1.66
1.60
0.92
2.12
2.84
1.84
2.50
1.08
1.32
0.92
0.24
1.36
3.42
2.98
0.12
1.66
0.84
1.28
2.48
2.20
1.38
1.96
0.64
1.58
1.82
1.90
3.22
1.58
4.46
2.50
7.08
1.70
2.20
1.56
0.9 - 1.8
C3c
1.412
1.360
1.264
1.490
1.302
1.588
1.396
1.516
1.974
1.600
2.06
1.468
1.230
0.682
1.058
0.472
1.842
1.538
0.976
1.748
Correlazione fra
risultati e analisi
NO
SI
NO
IN PARTE
NO
IN PARTE
NO
NO
SI
IN PARTE
SI
NO
NO
NO
NO
SI
IN PARTE
IN PARTE
NO
NO
13 / 19
Il campione 2 è risultato negativo per β 1 e β 2 e negativo per le proteine ricercate, quindi c’è buona
correlazione nel senso che il gel non dimostra falsi positivi.
Per i campioni 10, 12 e 19 si può notare un ottima eguaglianza tra il valore delle beta riscontrato nel
gel e la conferma con la ricerca delle singole sieroproteine.
Nei dettagli:
- il campione 10 ha dimostrato dal grafico dell’elettroforesi un aumento della frazione β 2 , il valore
di C3c è effettivamente aumentato.
- il campione 12, come per il 10, dove il gel ha mostrato un picco in β 2 il complemento è risultato
aumentato.
- per il campione 19 invece il caso opposto, dove β 1 e β 2 sono risultate diminuite al grafico di
elettroforesi, pure alla ricerca delle singole proteine si è visto un valore diminuito.
Nei campioni 4, 7, 11, 20 e 22 c’è una correlazione parziale nel senso che solo una banda delle beta
risulta corretta. Per esempio avere una β 1 aumentata con rispettive proteine e delle β 2 anche
aumentate ma senza le corrispondenti proteine (campione 7).
Il campione 4 presenta una particolarità. Testimonia come parte della frazione β 2 vada a
nascondersi sotto la frazione β 1 . In effetti avendo valori ai limiti come in questo caso, la precisione
con cui vengono delimitati i picchi risulta molto importante.
Il campione 7 ha le bande β 1 e β 2 aumentate, ma solo le lipoproteine, quindi di classe β 1 , risultano
aumentate.
Anche i campioni 11 e 22 dimostrano un caso simile al 7.
Il campione 20 invece correla per le β 2 ma non per le β 1 , difatti l’aumento delle lipoproteine non è
evidenziato con l’aumento della banda rispettiva.
Per contro gli altri campioni non rispecchiano le bande con le proteine misurate, nel senso che dove
è presente un aumento della banda beta non c’è il corrispondente valore alto delle proteine e
viceversa.
14 / 19
Si è visto che il nuovo gel dimostra una migliore separazione delle proteine seriche rispetto al gel
tradizionale, nella figura 10 questo è molto ben visibile indicato dalle frecce rosse:
Figura 10: il gel tradizionale e il gel nuovo messi a confronto
Nel primo gel HYDRAGEL PROTEIN 15/30 la banda β indicata dalla freccia è singola e ben
definita, nel secondo gel HYDRAGEL β1-β2 15/30 si può notare che la stessa banda è suddivisa in
due, appunto in β 1 e β 2 .
15 / 19
8 Conclusioni
I risultati correlanti e quindi a favore del nuovo gel hanno dimostrato la capacità di quest’ultimo di
separare con più sensibilità le proteine.
Per quanto riguarda i risultati non correlanti consideriamo alcuni punti:
- probabilmente ci sono più proteine che andrebbero prese in considerazione come per esempio
fibrinogeno, complemento C4 o immunoglobuline;
- a causa della scarsità di siero dei campioni all’inizio del lavoro è stato necessario diluire ogni
campione 1:2 con NaCl soluzione fisiologica. Come già detto in precedenza ogni campione è stato
trattato allo stesso modo;
- come valori di riferimento per tutta la ricerca sono stati utilizzati quelli del sistema informatico
LAB400 del laboratorio LC-CIC, OSG Bellinzona e non quelli forniti dalla ditta SEBIA. Questo gia
per il sistema tradizionale di elettroforesi, in quanto dopo una ricerca erano stati creati dei limiti
interni perché quelli forniti dalla ditta SEBIA non si adattavano alla routine.
Per questo motivo ho contattato la ditta SEBIA per avere ulteriori indicazioni ed eventuali consigli
in merito, purtroppo al momento della stesura definitiva non si disponeva ancora della loro risposta.
Sarebbe interessante in un futuro poter ampliare questa ricerca tramite accertamenti, in quanto il gel
testato si è dimostrato interessante e promettente e di utilità sicuramente per il medico, dato che
darebbe la possibilità di fornire informazioni in più su queste determinate proteine, ma per poterlo
inserire nella routine di laboratorio bisogna innanzitutto chiarire le situazioni di contrasto per poter
fare affidamento ai risultati.
16 / 19
9 Ringraziamenti
• Per la pazienza, il tempo concesso, i preziosi consigli, la disponibilità e la conoscenza messa a
disposizione:
Relatore e responsabile personale Dr. Franco Keller; Bellinzona
Capo laboratori LIC e centrale OSG Roberto Francesconi; Bellinzona
• Per la disponibilità durante la routine e nei giorni feriali:
Personale del laboratorio LIC; Bellinzona
Personale del laboratorio centrale OSG; Bellinzona
• Per la metodologia, l’aiuto nella redazione e i consigli didattici:
Vice direttore SSMT Andrea Boffini, Locarno
Docente chimica clinica SSMT Togni, Locarno
Responsabili SSMT Sonja Marci, Daniela Marcacci, Micaela Zenger; Locarno
• Per la redazione del riassunto inglese e l’aiuto con la lingua:
Docente inglese SSMT Gilbert Susan
• Per i consigli e l’aiuto nelle correzioni:
Rickenbach Joëlle, Witschi Michael
• Ogni singola persona che mi ha aiutato e sopportato nella stesura di questo lavoro.
17 / 19
10 Bibliografia
Testi e citazioni:
1
HYDRAGEL 30 β1-β2, manuale per l’operatore fornito nel kit dalla ditta SEBIA
2
Immunologia, dispense corso scolastico per laboratoristi medici; Ver. Corso 2003/2004,
Dr.Keller
Tabelle e grafici:
Immagine di copertina Gel HYDRAGEL 30 β1-β2 dopo colorazione
Figura 1 HYDRAGEL 30 β1-β2, manuale per l’operatore fornito nel kit dalla ditta SEBIA
Figura 2 Immunologia, dispense corso scolastico per laboratoristi medici; Ver. Corso 2003/2004,
Dr.Keller
Figure 3, 4, 6 Fotografie effettuate nei laboratori dell’ospedale OSG, 6500 Bellinzona
Figura 5 http://www.rochediagnostics.pl
18 / 19
11 Allegati
1.
Copia dei gel dopo colorazione
2.
Grafici delle letture al densitometro del gel tradizionale
3.
Grafici delle letture al densitometro del gel testato
4.
Metodica HYDRAGEL 30 β1-β2, manuale per l’operatore fornito nel kit dalla ditta
SEBIA
19 / 19